细胞生物学研究方法

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1、第三章细胞生物学研究方法一、显微镜技术二、细胞的分离及培养三、细胞组分的分离分离四、细胞内分子的示踪五、基本的分子生物学实验技术第一节显微镜技术光学显微技术：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微技术：以电子束为光源。纳米显微技术构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。（一）光学显微镜技术普通光学显微镜的分辨极限是0.2微米思考：如何提高显微镜的分辨能力？几种介质的折射率介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandM

2、icrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。染色体的端粒（FISH）支原体的检测Hela细胞未经染色的玻片标本（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。适合观察活细胞内细胞核,线粒体等结构暗视野梅毒螺旋体在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是

3、光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。不同光线的波长Yeastcell细胞融合最成熟的应用——单克隆抗体的应用第三节细胞组分的分离和纯化技术（一）差速离心Differentialcentrifugation在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。LowspeedHighs

4、peedDifferentialcentrifugation（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、平衡沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。1、速度沉降velocitysedimentation用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。(沉降系数不同)特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：

5、介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.平衡沉降equilibriumsedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。所需的力场通常比速度沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentationPCR1985年KaryMullis发明了一种模拟DNA体内复制

6、过程在体外复制特定DNA片段的的方法，命名为聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR。KaryMullis因此获得了1993年诺贝尔化学奖。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个核苷酸；③4种dNTP；④TagDNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermusaquaticus，最适作用温度75~80℃，短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，

7、当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量增加一倍Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限

8、制性内切酶