细胞生物学研究方法细胞生物学.ppt

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1、第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜:以可见光为光源电子显微镜:以电子束为光源一、光学显微镜技术（一）普通光学显微镜1.结构:①照明系统:光源和聚光器②光学放大系统:物镜和目镜③机械装置:用于固定材料和观察方便双筒显微镜单筒显微镜2.原理:经物镜形成倒立实像,再经目镜进一步放大成像。3.几个概念:①放大(率)倍数:显微镜最后形成的物体放大像与被检物体的大小比例,即像高比物高。②分辨力(resolvingpower):指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力。③数值孔径(镜口率)（NumericAperture）：N

2、A=ｎsin(α/2)光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N.A．其中λ为入射光线波长；N.A．为镜口率＝ｎsin(α/2)；n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。表一、几种介质的折射率4.显微镜的几个光学特点制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。镜口角总是要小于180，所以sin(a/2)的最大值必然小于1对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，因此普通显微镜的最大分辨率数值不会小

3、于0.2μm，人眼的分辨力是200μm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000倍。(二)相差显微镜(phase-contrastmicroscope,PCM)由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别。P31在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：1.环形光阑（annulardiaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光

4、线形成空心光锥，焦聚到标本上。2.相位板（annularphaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ环状光阑装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体——相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。原理图:微分干涉显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）当两束光通过光学系统时会发生相互干涉，如果相位相同，干涉的结果是亮度增强，反之，就会相互抵消变暗，这就是光

5、波的干涉现象。微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光汇合，从而样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器，如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。(三)荧光显微镜技术(Fluorescencemicroscope)1.荧光显微镜的特点:①光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜②照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上③有两个特

6、殊的滤光片，激发光滤片用以滤除可见光，目镜和物镜之间的阻断滤片用于滤除紫外线，用以保护人目荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色）荧光标记:同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记（四）、激光扫描共焦显微境激光共聚焦扫描显微镜光路图激光扫描共焦显微镜的特点:用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，能显示细胞样品的立体结构分辨率大约是普通光学显微镜的3倍用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管(五)暗视野显

7、微镜光路图聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。(六)倒置显微镜倒置显微镜inversemicroscope物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。二、电子显微镜技术(electronmicroscope)（一）、透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM）1932年Ruska发明原理:(电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样)用电子束作光

8、源，用电磁场作透镜,电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短.分辨率0.2nm,放大倍数为数百万倍.用于观察超微结构(ultrastructure),及小于0.2μ