细胞生物学研究方法

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1、第三章　细胞生物学研究方法本章内容：细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术用于细胞生物学研究的模式生物细胞形态结构的观察方法光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。普通光学显微镜1.构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。3.分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。分辨距离越小，则分辨能力越高。R=0.61λ/N．A．λ为入射光线波长；N．A．（镜口率）＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。思考：

2、如何提高显微镜的分辨能力？N·A：显微镜物镜的镜口率—光学性能指标，每个物镜上都标有其镜口率的数值）。几种介质的折射率:显微镜的几个光学特点：①制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。②sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。③普通光线的波长为400~700nm，分辨率数值不会小于0.2μm，人眼的分辨率为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。④普通光镜分辨率的理论极限应为0.2μm。0.2μ就是显微水平与亚（

3、超）显微水平的分界线。物镜镜口率受入射镜口角和介质折射率的限制，不可能有更大提高。所以科学家们从另外两个途径来改进显微镜：①换用短波长的“照明光源”，来提高分辨能力。如：紫外光显微镜，电子显微镜②应用特殊光学效应，增强反差，来提高分辨能力。荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：光源为紫外线，波长较短，分辨能力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质进行定性和定位分析。荧光现象有两种：　①自发荧光：细胞内某些天然荧光物质被紫外光照

4、射所激发的荧光，例如叶绿素（血红色自发荧光）；　②诱发荧光：在细胞中加入荧光染料（荧光素），与细胞内某种特定成分结合在一起，经紫外光照射激发出荧光。例：荧光染料吖啶橙，可使RNA发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。荧光显微镜与普通光镜在结构上不同之处：（1）采用紫外光发生装置：高压汞灯+激发装置+滤光装置；（2）透镜由石英玻璃制成，以便减少光通路上的紫外光损耗；（3）目镜中要装压紫滤片。荧光显微镜的应用Eg;以荧光素标记各种探针，进行基因定位分析或对某些特定蛋白质进行定性定位检测分析,灵敏清晰。Eg:对样品可同时采用两种以上荧光探针检测，依

5、据其不同颜色的荧光信号，一次判断识别多个基因位点。Eg:用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。激光扫描共焦显微境（Laserscanningconfocalmicroscope）①用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。②能显示细胞样品的立体结构。③物镜和聚光镜是聚焦同一焦点，能排除焦平面以外荧光的干扰，所以其分辨率比普通荧光显微镜提高1.4-1.7倍。④用途类似荧光显微镜，以“光学切片”方式观察较厚样品的内部结构，但能扫描不同层次，形成立体图像。相差显微镜光波的三个光学特性：①波长：对于光波波长变化，肉眼觉察为

6、颜色变化;②振幅：对于光波振幅变化（即振幅差），肉眼觉察为明暗变化；③相位：指某一时刻，光在其前进路线上的位置。对于光相位的变化（即相位差），肉眼不能觉察。当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体（例如活细胞），其波长和振幅都无明显变化，仅光相位出现一定程度变化，此时观察会感觉反差较小，物体内部的结构难分辨，这就是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因。相差显微镜原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。①环形光阑（annulardiaph

7、ragm）：位于光源与聚光器之间。作用：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。②相差板（annularphaseplate）：物镜后加了涂有氟化镁的相差板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地使这两组光波之间微弱的相位差加大，再经过光波干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振幅差，从而反差增强，便能够清晰看到被检物体及其内部细微结构了。相差显微镜下的样品不需染色，可以清晰观察活细胞及其内部结构的变化。（一）微分干涉显微镜Differentialinterfe

8、rencecontrastmicroscope（DIC）1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标