3-细胞生物学研究方法

《3-细胞生物学研究方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章　细胞生物学研究方法2014-03-03Idea技术、方法发现问题形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识进行初步观察提出问题引自http://www.sciencenet.cn/m/user_content.aspx?id=355449参照TheScientist"EvolutionofScience"http://www.the-scientist.com/article/display/57368/内容提要细胞形态结构的观察方法—显微镜技术细胞组分的分析方法细胞培养与细胞工程细胞及生物

2、大分子的动态变化模式生物与功能基因组研究1显微镜技术1.1光学显微镜技术（lightmicroscopy）1.2电子显微镜技术(electronmicroscopy)1.3扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope)分辨率也叫分辨力，指区分开两个非常靠近的物体（或点）的能力。物镜决定分辨率的高低。通常是用相邻两点间的距离来表示。相邻两点的距离越小，光学显微镜技术说明分辨率越高。放大倍数：眼睛看到的像的大小与对应标本大小的比值，取决于物镜以及目镜的放大倍数。反差：指被观察结构不同部位的明暗程度。分辨率

3、和哪些因素有关呢？波长与分辨率D=0.61N.Sin/2：光源波长：物镜镜口角（最大值可达140度）N：介质折射率（空气中为1）最短的可见光为450nm若在油镜下，N可提高到1.5，因此：D=0.2μm(光学显微镜最大分辨率)1.1.1普通光学显微镜技术1.1.2相差显微镜和微分干涉显微镜技术1.1.3荧光显微镜技术1.1.4激光扫描共焦显微镜技术光学显微镜技术光学放大系统照明系统机械和支持系统目镜物镜光源折光镜聚光镜（滤光片）1.1.1普通光学显微镜技术目镜物镜集光器载物台光源正置显微镜和倒置显微镜1.1.2相差显微

4、镜（phase-contrastmicroscope）发明：1935年，荷兰物理学家Zernike设计和发明相差显微镜，并获得1953年诺贝尔物理奖。原理：把透过标本的可见光的相位差变成振幅差，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。优点：样品不需染色，可以观察活细胞。振幅差与相位差结构聚光器或光源上增加一环状光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上；物镜后装有一块“相差板”，相差板上涂有特殊物质；偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的相位差，从而对样品密度的不同造成的相位差起“夸大”作用；吸光区半

5、透明圆环不透明的涂漆部分透明的环状部分用途：观察未经染色的玻片标本微分干涉显微镜技术（differential-interferencemicroscope）Nomarski(1952)在相差显微镜原理的基础上发明的：又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大。DIC显微镜相差显微镜普通显微镜1.1.3荧光显微镜（Fluorescencemicroscope）特点：光源为紫外线，波长较短，有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。分辨率高于普通显微镜

6、；应用于对特异蛋白质等生物大分子定性定位。1）分为：免疫荧光技术荧光素直接标记技术2）原理：（以免疫荧光技术为例）特定抗原（细胞）抗体抗体－抗原复合物进行定位测定荧光素激发光不同的荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上的荧光素（如：紫外线）Figure3-64.Indirectimmunocytochemistry.Themethodisverysensitivebecausetheprimaryantibodyisitselfrecognizedbymanymoleculesofthesecondarya

7、ntibody.Thesecondaryantibodyiscovalentlycoupledtoamarkermoleculethatmakesitreadilydetectable.Commonlyusedmarkermoleculesincludefluoresceinorrhodaminedyes,theenzymehorseradishperoxidaseorcolloidalgoldspheres,andtheenzymesalkalinephosphataseorperoxidase.Immunostaining

8、confirminginvitrodifferentiationintoallthreegermlayers.Scalebars=100μm.SecondaryantibodieswerelabeledwithCy3(red),exceptforα-fetoproteinin