酿酒酵母的大规模液体发酵生产

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1、生物工程综合实验实验酿酒酵母的大规模液体发酵生产实验原理本实验通过对15升中型发酵罐的了解及使用，将整个微生物发酵生产过程分成几个阶段，系统的表现了发酵生产工艺流程，包括使用发酵设备前期整个设备给水、给无菌空气、给高压蒸汽管路及其排放管路的了解，以及在实际操作过程中各个管路之间的切换，发酵用各个检测设备的标定。并以酿酒酵母的纯化培养开始、再进行摇瓶放大、最后实现发酵罐的发酵生产的具体实验过程，让学生学会在发酵过程中能够分阶段的进行采样检测，根据检测值对发酵的条件进行必要的调节，最后对于发酵所得到的产物进行必要的分离纯化，制成成

2、品并保存，从而掌握整个发酵生产工艺流程的具体实施过程。实验简介15升发酵罐图示发酵罐罐路示意图空气流量计电加热器冷凝管空气水蒸气A03A02A01S03S01S02VT1V01P02W01C01W03W02罐体管路说明一、空气及其净化来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气预过滤器）进入发酵罐空气总管，空气流量计A01、阀A02、单向阀、空气过滤器、阀A03到达反应器内，尾气经阀排出，本管路具有计量、净化作用。注：空气流量级显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。二、蒸汽蒸汽进夹套蒸汽

3、经阀S01进入夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。蒸汽对培养基预热。蒸汽进反应器蒸汽经阀S02、单向阀、空气过滤器、阀A03进入罐内，由排气口控制阀VT1排出。蒸汽对过滤器及空气管线消毒。蒸汽进取样阀及放料阀蒸汽经阀S03进入取样阀，由阀P02排出冷凝水。蒸汽对取样阀及底阀灭菌。三、自来水自来水进夹套当电磁阀C01打开时，自来水经自动注水阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套上口、阀W02、加热器、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电加热器、循环泵、单想阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能

4、带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。注：温度自动前必须对夹套注水自来水进排气冷凝器自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发。实验步骤葡萄糖1g氯化钾1.8g酵母浸膏2.5g醋酸钠8.2g蒸馏水1000mL一、发酵前的准备工作1．酵母菌活化：由种子活化到试管斜面上。2．按照下列配方配制麦氏（Meclary）培养基300ml，113℃灭菌20min。将300ml种子培养液分成两份，无菌操作取酿酒酵母菌斜面菌苔，接种于种子培养液，摇床培养24－48小时。3．补料液的配制及灭菌：配制0.2mol/L

5、NaOH溶液、0.6mol/LHCl溶液、食用油分别装入补料瓶中，将连在补料瓶上的橡皮管，用绳子扎紧，121℃灭菌20min。4．培养基的制备：酵母膏25g、NaAc82g、KCl18g、葡萄糖10g。加水溶解搅拌均匀。5．溶氧电极标定：零点标定：将电极拔出浸没于饱和的无水亚硫酸钠溶液中，待电极显示值稳定后标零点1％。斜率标定：溶氧电极的斜率（满度）标定一般在发酵之前，温度、罐压、通气量均在正常情况下进行，一般以100％标定，因为它是个相对值，也可以是其他数值，罐压对溶氧量影响较大，标定时应保持罐压相对稳定。6．pH电极标定：

6、pH电极零点和斜率不能在发酵状态下标定，只能在灭菌以前进行，但可以在发酵过程中进行零电位补偿。标定前电极需泡于液体中并已联机1小时以上，通常采用两点标定法：先将电极洗净擦干，然后浸入6.86缓冲液，并将零点标定值设为6.86，然后按开始标定键，待pH显示值稳定后可按零点标定结束键，然后洗净擦干电极后同样方法标定斜率，然后再标定零点，反复至更换缓冲液时，pH未经标定已达标准值（附近）即可。7．蠕动泵流量标定蠕动泵的标定随时可以进行。可以对酸、碱泵、补料泵、消泡剂泵进行标定，方法相同。先取定量的液体，安装好，然后在标定画面上设为标

7、准容量。然后将手、自动开关调节到手动位置，使泵运转并将管内空气排出开始滴液，将出口液体滴入标准容器，同时按标准开始键并确定，此时开始以秒为单位计数，待输出液体到达设定的标准容量时，再按确定。整个标定过程结束。此时，加料速度便由控制器显示出来。标定结束后将开关置于“关”的位置。8．将4步骤配制好的培养基加入发酵罐中，加水至体积约11.5升（防止水蒸发过多）。二、实罐灭菌操作1、准备盖紧罐盖上的各种盖帽，旋紧罐盖上的压紧螺栓，关紧发酵罐底阀P01，倒入培养基，调整pH值，旋紧接种口。关排气冷凝器进水W03，移去进出口的软管排尽冷凝

8、水夹套中的水2、培养基预热准备工作预先启动蒸汽发生器及空气压缩机。将控制器中的温度控制设定为手动开排气阀VT1，关闭其他所有阀们开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其他阀门。启动反应器搅拌马达。调节转速200-300rpm。蒸汽进夹套：缓慢开夹套蒸汽阀S01蒸汽