兔声带成纤维细胞的体外分离培养_鉴定与标记

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1、军医进修学院学报2010Jun，31（6）·589·JChinesePLAPostgradMedSch兔声带成纤维细胞的体外分离培养、鉴定与标记牛玉光，黄冬雁，王荣光解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，北京　100853摘要：目的探讨体外培养兔声带成纤维细胞(VocalFoldFibroblasts，VFFs)的培养及标记方法。方法消化培养法分离、培养兔声带成纤维细胞，倒置显微镜观察其生长和形态特征，并传代、鉴定。增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体(Ad-EGFP)标记体外培养的VFFs，取12只新西兰兔，以1×1

2、00万/0.1ml分别注入损伤模型左侧声带，观察注入VFFs的生长情况。结果兔声带成纤维细胞可以在体外原代和传代培养，具有成纤维细胞的典型形态。波形蛋白免疫荧光染色阳性，Ad-EFGP可以成功转染VFFs。将VFFs诸如声带后15d，组织学切片未发现成活细胞。结论用消化培养法可成功获得VFFs，Ad-EGFP是一种理想的示踪标记物。关键词：声带；成纤维细胞；兔中图分类号：R767.4　　文献标识码：A　　文章编号：1005-1139(2010)06-0589-03Invitroculture,ident

3、ificationandlabelofrabbitvocalcordfibroblastsNIUYu-guang,HUANGDong-yan,WANGRong-guangDepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,ChinaCorrespondingauthor:HUANGDong-yan.Email:huangdy301@sina.comAbstract:ObjectiveToi

4、nvestigatethebestmethodtocultureandlabelvocalfoldfibroblasts(VFFs)invitro.MethodsVFFswereculturedbyenzymedigestiontoobservetheirgrowthandmorphologyunderaninvertedmicroscopeandlabeledwithAd-EGFP.Thecells(100million/0.1ml)wereinjectedintothevocalcordsof12N

5、ewZealandrabbitstoobservethegrowthofVFFs.ResultsVFFscouldbeculturedinvitroandshowedcharacteristicmorphologyoffibroblasts.ImmunochemistryshowedpositivevimentinexpressionAd-EGFPcouldtransfectVFFs.Nosurvivedcellswereobservedonthetissuesections15daysafterinj

6、ectionofVFFs.ConclusionVFFscanbeculturedbyenzymedigestion.Ad-EGFPisanidealtracingmarker.Keywords:VocalCords;Fibroblasts;Rabbits声带具有分层结构，其中固有层是维持声带胎牛血清(Gibeco公司)，0.25%胰蛋白酶(Gibeco振动，黏膜波产生及正常发音功能的重要组织结公司)，Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)，Vimentin单克构。成纤维细胞是声带固有层最重要的细胞成分，隆抗体(小

7、鼠来源，Sigma公司)，FITC-山羊抗小具有产生和降解固有层细胞外基质成分的功能，鼠二抗(武汉博士得公司)，DAPI(SantaCruz公司)，以保持固有层细胞外基质成分的稳定，维持声带Ad-EGFP(本元正阳基因技术有限公司)，青霉素黏弹性特性。因外伤或疾病损伤后所形成的声带(100μg/ml)、链霉素(100μg/ml)，PBS缓冲溶液。瘢痕影响正常发声。声带瘢痕通常发生在声带固2动物取材　3只月龄4个月健康新西兰兔，雌有层，由于胶原纤维沉积等瘢痕性变化，改变了雄不限，体质量2.0-2.5kg，

8、购自解放军总医院动声带的生物力学特性，影响声带振动及黏膜波的物实验中心。耳缘静脉空气栓塞，兔子腹部向上[1]产生。本实验是通过体外消化培养的方法获得将其固定于木板上，用组织钳将黏膜、肌肉逐层VFFs，为声带瘢痕修复过程中成纤维细胞作用的分离，在甲状软骨正前方裂开喉，暴露声门，用研究创造条件。组织剪将声带(含杓状软骨)全部取出，放入装有7mlDMEM细胞培养液的培养皿中。材料和方法3消化法培养兔VFFs　组织清洗：将取下的组织31试剂　培养液