人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定

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1、人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定作者：马英智张丽红孙梅李玉林【摘要】目的对人真皮成纤维细胞(hFbs)进行分离培养及鉴定，为组织工程复合皮肤的构建提供种子细胞。方法利用组织块培养法、消化传代纯化培养hFbs，通过细胞形态的观察及免疫细胞化学、流式细胞术等方法对其进行鉴定。结果经组织块培养法获得的细胞可以传代培养，从P1代到P6代细胞形态保持一致，呈纤维细胞样生长;免疫细胞化学检测可见波形蛋白(vimentin)呈阳性反应，通过流式细胞术检测P3及P6代的细胞vimentin阳性表达量均达到95%以上，角蛋白15(cytokeratin1

2、5)呈阴性表达。结论成功建立体外稳定培养hFbs的方法，为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。【关键词】成纤维细胞;分离;培养;鉴定　　【Abstract】ObjectiveToexploreamethodoftheisolation,cultureandidentificationofhumanfibroblasts(hFbs)invitrofortheprovisionofseedcellsintissueengineeringskin.MethodsThecellswereculturedandexpandedandobser

3、vedunderphasecontrastmicroscope,andtheywereidentifiedwithimmunocytochemistryandflowcytometry(antivimentin,cytokeratin15).ResultsWithphasecontrast7microscope,thecellswereobservedtouniformedpopulationofcellsandfibroblastlike.Immunocytochemistryandflowcytometryshowedallcu

4、lturalcellswerefibroblasts(positiveforvimentin,negativeforcytokeratin15).Thecellsweresubcultured6generations.ConclusionsAmethodforisolatingandculturinghFbsinvitroisestablishedsuccessfully.　　【Keywords】Fibroblasts;Isolation;Culture;Identification　成纤维细胞是构成皮肤真皮的主要细胞，其正常的增殖、

5、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。本实验旨在探索一种简单、高效分离培养人真皮成纤维细胞(humanfibroblasts，hFbs)的技术方法，为进一步利用组织工程学构建复层皮肤奠定基础。　　1材料与方法　　1.1主要试剂DMEM/F12(Gibco)，优等胎牛血清，DispaseⅡ(Roche)，胰蛋白酶(Sigma)，TritonX100(Sigma)，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Santa)，兔抗人角蛋白15单克隆抗体(Abcam)，免疫组化SP试剂盒(迈新)，DAB显色液(迈新)，FITC标记的抗鼠和抗兔IgG(北京中杉)。

6、7　　1.2hFbs的分离培养　　1.2.1原代培养取包皮环切术的正常皮肤组织，用含青链霉素的PBS冲洗3次，尽量去除皮下结缔组织;将皮肤剪成小块，真皮面朝下平铺于平皿中，加入DispaseⅡ4℃条件下过夜;次日分离表皮真皮，将真皮剪切成小块，接种于35mm培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养1h，加入少量含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)，次日加入足量培养基继续培养，以后每3d换一次液。　　1.2.2传代用0.25%胰酶0.02%EDTA消化约1min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入含10

7、%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)终止消化，用吸管吹打细胞，以1∶3比例传代培养。　　1.3形态学观察利用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态变化。　　1.4免疫细胞化学取爬片的P6代细胞，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定20min;PBS清洗，0.1%TritonX100孵育10min;3%的过氧化氢室温阻断20min;PBS清洗，血清覆盖20min;稀释度为1∶100的鼠抗人波形蛋白(Vimentin)一抗和兔抗人角蛋白(Cytokera7tin，CK)15一抗4℃过夜;PBS清洗，加入二抗室温孵育30min;PBS清

8、洗后加DAB，苏木素复染;同时用PBS代替一抗作阴性对照，显微镜下观察照相。　　1.5流式细胞术用0.25%胰酶0.02%EDTA消化收集P3和P6代细胞，使其细胞数为2×105个/每例样本;PBS清洗，