大鼠胚胎皮肤成纤维细胞培养鉴定及真皮层内移植存活性的实验研究

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究俸篷耋要贡献豹令入和集体，均纛在文孛戳暖确方式标骧。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名_兹煎日期：磁：圭：!f关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或商国家有关部门或机构送交论文的复印侔和电子舨，允许论文被查溪耱借阕；本人授权由东大学霹数将零学位论文懿金邦或部分

2、内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：盈妊导筛签名：．．窆墨日期：趟：§妥山东大学硕士学位论文大鼠胚胎皮肤成纤维细胞培养鉴定及真皮层内移植存活性的实验研究专业：硕士研究生：导师：外科学(整形)张诚王一兵副教授中文摘要目的：利用体外组织细胞培养及胚胎无瘢痕愈合的一般原理，在体外原代培养胚胎大鼠皮肤成纤维细胞，探索和建立大鼠胚胎皮肤成纤维细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。观察大鼠胚胎皮肤成纤维细胞在正常皮肤以及

3、深二度烧伤创面注射移植后的存活情况．方法：分别用组织块法和酶消化分离法原代培养处于无瘢痕愈合期的Wistar大鼠胚胎皮肤成纤维细胞，对两种方法获得细胞的情况进行比较。用胰蛋白酶1-EDTA消化加反复贴壁法分离纯化成纤维细胞。倒置相差显微镜下观察原代培养及传代过程中成纤维细胞的形态学特征。制备细胞爬片。对培养的成纤维细胞用SP方法作免疫细胞化学染色(immunocytochemistry，ICC)，第一抗体分别为波形蛋白(vimentin)、结蛋白(desmin)、角蛋白(pancytokeratin)

4、。选取生长状态良好的细胞，制作标本，用透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)观察胚胎成纤维细胞的超微结构。用组织块法和酶消化法对成年Wistar大鼠皮肤成纤维细胞进行培养，并对两类细胞生长以及功能活动情况进行简单的比较研究．细胞计数法绘制两种细胞的生长曲线。流式细胞术(flowcytometry，FCM)测定比较处于对数生长期的两种细胞的细胞周期情况，细胞各周期的酉分比测定结果以x±S表示，作组间，检验进行统计学分析，P

5、成年健康Wistar大鼠12只，每只体重约2509左右，随机分为两组，A组为正常皮肤移植组，B组为烧伤创面移植组。A组每只背￡●l』，山东大学硕士学位论文部选择两个煎径为3cm移植区域，B组每只大鼠背部制造两处直径为3cm的深二发烧伤创面(经病理学检查诚实)。将处予对数生长期生长状态良好的细胞制成细胞悬液，用羰花青类荧光活性染料衍生物CM．Dil(chlofome柏vlbenzamidoderivativesofDil)进褥标记，注慰穆植于A、B组皮肤真皮层内．移械后分别于l、3、7、14、2l、28

6、d6令时攘点取材，傲球冻切黪，在荧光显徽镜下鼹察缨勰存活壤猛。结果：’1．与缓织块法耱毙，怒簿瀵纯法可受抉捷姥获霉熙多懿成纤维纲胞，分离的成纤维细胞可巍体外快速贴熬生长，增殖，倒置相差显微镜下戏察细熙呈长棱形，擎核。兔疫缨蕤讫学染色缝聚显示波形蛋露呈阳性反应，而结蛋白、角蛋白璧阴性成应，透射电镜观察结果为典型的戏绎维缨憝形态学特缝。2．细胞生长曲线结果擞示胚胎大鼠皮肤成纤维细胞比成年大鼠皮默戚终维缨藏奏更强爨冬增熬分裂裁力。浚式鲴熬搜对嚣秘缨藏震期憝分析结果显示，胚胎皮肤成纤维细胞s期百分比明显多于成

7、年皮肤成纾维缨麓(夕《0。05)。3．胚胎皮肤成纤维细胞移植后荧光魏微镜观察结果显示：A组备孵耱煮缘骞信号存东，第l天、第3天荧蹩蓦警较乡，第7夭秀：始瓒多，第14天、第21天时荧光信号最多，甩分布均匀，第28必仍有信号存奁；B维繁l天、第3天骞荧笼岩弩存在，第7灭霞骞擞弱荧怒信号，以后各时相点均未检测到荧光信号。结论：1．酶消化法是培养胚胎大鼠皮肤成纤维细胞简便、快捷的方法。该方法绣获{!攀熬残绎维缨黪霹在俸努稳定培养，秀在缫麓承警主研究伤口愈合的机制提供了充足，可靠的细胞模型。2．艇黯疲获成绎维缨

8、稳笼残年太鬣躐绎缝缀麓表淡燕更麓豹增疆活性．3．荧光露号鬟察结栗表臻磊耱异俸释髓残纾维缁魏芷零受获真受层内移植后能够在体内存活；在深二度烧伤创面真皮层的存活期较短，为其骚臻瘟焉提供了裙步静溪论蔹据。关键词：残纾缎绥戆：缨稳，培养静：缨激移植；荧宠絷辩2山东大学l醺士学位论文EXPERIMENTALSTUDIES0NCULTIVATION．IDENTIFICATIONANDTRANSPLANTATIONoFFETALRATSKINFIBRoBLASTSPo