小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究

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1、西南大学硕士学位论文小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究姓名：何允申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：李跃民20120601摘要小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法的研究●摘要哺乳动物的早期性别鉴定是人为进行性别控制的手段之一。在畜牧业生产中，通过性别控制能够建立优化商品畜群，充分发挥母畜的繁殖能力及公畜的生长优势，提高畜产品经济效益，并能够在生产前排除潜在有害基因型，防止性连锁疾病：在分子生物学、胚胎细胞学及发育遗传学等基础学科的研究中，胚胎性别鉴定是探索胚胎发育机制、深化干细胞研究、实现肿瘤分子调控等热点研究课题的环节之一；胚胎成纤维细胞具有细胞体积大数目多、来源广泛且

2、取材方便以及在体外培养条件下能够迅速生长繁殖，并且能够长期传代等优点，广泛应用于胚胎干细胞的分离与培养、体细胞克隆与核移植等课题的研究，因此小鼠早期胚胎及成纤维细胞的性别鉴定在畜牧生产、遗传育种、胚胎发育学及临床应用范围内均具有实用价值。本课题使用双重PCR法对小鼠附植前8．细胞胚胎以及小鼠胎儿成纤维细胞进行了性别鉴定，旨在探寻一种简便可靠的双重PCR性别鉴定方法，为小鼠ES细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植等研究提供参考。具体内容包括：(1)引物设计及其合理性检测：以雄性特异性SRY基因序列设计了一对特异性引物，即上游引物SRY250U：5’C1]广rTTCCAGGAGGCACAGA．3’及下游

3、引物SRY250L：5’母ACAGGCTGCCAATAAAA(圮．3’；以雄性及雌性共有的锌指结构ZFX基因序列设计另一对内标引物，ZFX399U：5’．AAGAGAGTCCATTCAAGTGTGA．3’为上游引物，ZXF399L：5’．GCTACC”广rGTTGCCGAAAT．3’为下游引物：使用离心柱式动物基因组DNA提取试剂盒提取小鼠肝脏组织DNA基因组作为模板，在适宜的反应体系及条件下，分别用两对引物进行体外扩增，扩增产物以2％琼脂糖凝胶电泳进行结果检测。结果表明SRY基因引物对能够对雄性基因组扩增出约250bp的目标条带，雌性基因组扩增结果为空白，而ZFX基因引物对可对雄性及雌性小鼠

4、肝脏组织基因组均扩增出399bp大小的目标条带：使用已知性别小鼠肝脏基因组为模板，同时用两对引物进行扩增，结果雄性小鼠扩增结果为内标条带及判断条带同时存在，而雌性小鼠扩增结果为399bp一个条带，说明试验所设计引物具备有效性及合理性；(2)将适龄健康的雌鼠注射PMSG和hCG后与雄鼠合笼，将见栓后2d的两南火学硕十学位论文雌鼠进行无菌手术，取出子宫并以M2操作液冲洗，得到2．5d胚龄的胚胎。将所得胚胎经O．5％链霉蛋白酶于37℃处理30s去除透明带，M2操作液洗涤后，从每个8-细胞胚胎吸取4个卵裂球用于性别鉴定：将卵裂球加入8此ddH20后以5此石蜡油覆盖，恒温煮沸5min后一20℃冰浴5商n

5、，14000叩m离心2mm，取上清液用于扩增，扩增体系为：ddH207¨l；10×Bu脏r3山；M矿+2pl；10×硼Bu虢r2．5“l；dNTP3}tl；引物P11pl；引物P2l山；DNA样本5“l：№酶1．5m；反应条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火60℃，35s；延伸72℃，40s，共30个循环；72℃，10mh，4℃保存。扩增结束后取5斗l产物在1．5％琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对40枚小鼠附植前胚胎进行性别鉴定，结果显示其中20枚胚胎电泳检测扩增结果出现250bp大小的判断条带及399bp大小的内标条带，由此判断此20枚附植前胚胎为雄性胚胎；12枚8．

6、细胞胚胎卵裂球提取DNA后进行体外扩增后，电泳结果显示399bp大小的内标条带，判断条带为阴性，因此判断为雌性胚胎；另有8枚胚胎因条带缺失或模糊不明无法进行性别判断。性别鉴定成功率为80．00％。(3)将适龄健康的雌鼠注射激素后与雄鼠合笼，13d后将雌鼠处死进行无菌手术，摘取完整子宫并以取出13．5d胎龄的胎鼠用于分离MEFs；将所得MEFs的细胞密度调整至1×106个／ml，于37℃、5％C02、饱和湿度培养箱中培养，每24h换液一次，待80．90％细胞贴壁时进行传代培养，并观察贴壁情况，得出F3代MEF贴壁及发育状况均优于其他代细胞；取第3代MEFs按离心柱型细胞基因组DNA提取试剂盒提取

7、总DNA；使用自主设计的SIW基因引物及ZFX基因引物对MEFsDNA进行体外扩增，扩增体系为：ddH207“l；10×Bu他r3“l；M92+2“l；10×T细Bu任-er2．5pl；d1、iTP3pl；弓I物Pl1山；弓l物P2lpl；DNA样本5pl：T硇酶1．5“l；反应条件为：预变性94℃，5min：变性94℃，30s；退火60℃，35s：延伸72℃，40s，共30个循环；72℃，10m