人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定论文

《人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定论文马英智张丽红孙梅李玉林【摘要】目的对人真皮成纤维细胞(hFbs)进行分离培养及鉴定，为组织工程复合皮肤的构建提供种子细胞。方法利用组织块培养法、消化传代纯化培养hFbs，通过细胞形态的观察及免疫细胞化学、流式细胞术等方法对其进行鉴定。结果经组织块培养法获得的细胞可以传代培养，从P1代到P6代细胞形态保持一致，呈纤维细胞样生长;免疫细胞化学检测可见波形蛋白(vimentin)呈阳性反应，通过流式细胞术检测P3及P6代的细胞vimentin阳性表达量均达到95%以上，角蛋白15(cytokeratin15)呈阴性表达。结论成功建立

2、体外稳定培养hFbs的方法，为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。【关键词】成纤维细胞;分离;培养;鉴定【Abstract】ObjectiveToexploreamethodoftheisolation,cultureandidentificationofhumanfibroblasts(hFbs)invitrofortheprovisionofseedcellsintissueengineeringskin.MethodsThecellsicroscope,andtheymunocytochemistryandfloetry(antivimentin,c

3、ytokeratin15).ResultsEM/F12(Gibco)，优等胎牛血清，DispaseⅡ(Roche)，胰蛋白酶(Sigma)，TritonX100(Sigma)，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Santa)，兔抗人角蛋白15单克隆抗体(Abcam)，免疫组化SP试剂盒(迈新)，DAB显色液(迈新)，FITC标记的抗鼠和抗兔IgG(北京中杉)。1.2hFbs的分离培养1.2.1原代培养取包皮环切术的正常皮肤组织，用含青链霉素的PBS冲洗3次，尽量去除皮下结缔组织;将皮肤剪成小块，真皮面朝下平铺于平皿中，加入DispaseⅡ4℃条件下过夜;次日分离表皮真

4、皮，将真皮剪切成小块，接种于35mm培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养1h，加入少量含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)，次日加入足量培养基继续培养，以后每3d换一次液。1.2.2传代用0.25%胰酶0.02%EDTA消化约1min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)终止消化，用吸管吹打细胞，以1∶3比例传代培养。1.3形态学观察利用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态变化。1.4免疫细胞化学取爬片的P6代细胞，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定20min;PBS清洗，0

5、.1%TritonX100孵育10min;3%的过氧化氢室温阻断20min;PBS清洗，血清覆盖20min;稀释度为1∶100的鼠抗人波形蛋白(Vimentin)一抗和兔抗人角蛋白(Cytokeratin，CK)15一抗4℃过夜;PBS清洗，加入二抗室温孵育30min;PBS清洗后加DAB，苏木素复染;同时用PBS代替一抗作阴性对照，显微镜下观察照相。1.5流式细胞术用0.25%胰酶0.02%EDTA消化收集P3和P6代细胞，使其细胞数为2×105个/每例样本;PBS清洗，0.1%TritonX100室温10min;PBS清洗，用稀释度为1∶50的鼠抗人V

6、imentin一抗和兔抗人CK15一抗常温下孵育30min;PBS清洗，加入稀释度为1∶50的FITC标记的抗鼠和抗兔的IgG为二抗，4℃避光孵育30min;PBS清洗2次，加入400μlPBS重悬细胞用于FACS分析。2结果2.1形态学观察利用倒置相差显微镜观察培养不同阶段的细胞形态，原代培养3d后，可见有细胞从组织块周围爬出，细胞呈纺锤状，如纤维细胞样生长。第7～10天时可见大量细胞生长，呈鱼群样。见图1。传代培养的hFbs生长旺盛，3～4d达到汇流，形态与原代相似、更加趋向一致。细胞呈长梭形，核呈椭圆形，可见1～2个核仁。本实验中hFbs可传代培养至11代

7、，其形态及生长特点无明显改变。2.2免疫细胞化学免疫细胞化学结果显示P6代hFbs中胞浆染成深棕色，见图2。Vimentin呈阳性，CK15呈阴性表达。图1原代培养第10天(×4)图2免疫化学染色(×20)2.3流式细胞术通过流式细胞术检测hFbs的标志，经3代以上传代后，细胞成分均一，Vimentin阳性细胞占总数的95%以上，具有较高的纯度;CK15阳性细胞占总数的4%以下，为阴性表达。3讨论组织工程是在20世纪80年代正式提出来的一个新概念，综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论和基本技术将分离培养的高密度功能细胞接种在可降解的三维支架材料上，其中种

8、子细胞的研究是组织工程众