QIAGEN中提DNA中文操作手册

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1、质粒DNA中提方法（QIAfiltermidikit25）适用于100微克的高质粒或粘粒DNA，使用QIAfilter注射器样元件代替常规离心法以清除细菌裂解物。低拷贝质粒，加入氯霉素放大后应视为高拷贝。为质粒选择适当的培养体系。在开始之前的注意事项■如果是低拷贝，最好增加裂解buffer的用量，以提高裂解效率，裂解缓冲卷，从而增加DNA产量。■可选：删除样品的步骤用符号表示☞为监测分析凝胶（见第34页）的过程。■加入bufferP3后，样品不再需要冰浴。在开始之前做的东西■把提供的RNaseA添加到bufferP1中。一瓶RNaseA(使用之前简要地离心）加入一瓶bu

2、fferP1，终浓度为100ug/ml。■检查bufferP2是否由于低温存储产生SDS沉淀。如有必要，37°C下使SDS溶解。.■在4°C预冷bufferP3。■可选：使用前将提供的LyseBlue试剂添加到bufferP1混合。每个bufferP1瓶加入一小瓶LyseBlue（在使用之前简要离心），达到1:1000稀释。LyseBlue可以提供视觉识别从而防止常见处理错误，如细胞裂解导致效率低下和不完全沉淀的SDS、基因组DNA污染、细胞碎片等。过程1.摇菌：新鲜划线的选择性平板（接种含有适当的选择性抗生素）挑一个单菌落放入2-5mlLB培养基中。在37°C摇菌约8

3、h（约300rpm）。使用4倍体系容积的试管或锥形瓶。2.稀释选择性LB培养基1/500-1/1000。若为高拷贝质粒，接种到25毫升或●100毫升的介质具有▲25—50µl或●100–200µl起始培养液。若为低拷贝质粒，接种▲50—100毫升或●250毫升的介质具有▲100–200µl或●250-500µl起始培养基。在37°C摇晃12–16h（约300rpm）。使用烧瓶或其他容器至少4倍于培养液体系。培养液细菌密度应该达到约3-4x109个/毫升3.收获细菌：6000xg、4°C离心15分钟。弃上清4.加入▲4毫升或●10毫升bufferP1。为保证高效裂解，重要

4、的是要使用是足够大，以允许完全混合裂解缓冲的容器。确保RNAraseA已被添加到bufferP1。如果LyseBlue试剂已添加到bufferP1，使用之前大力摇晃buffer，以确保LyseBlue粒子完全悬浮。细菌向上和向下翻转直到没有细菌块凝结。5.添加▲4毫升或●10毫升bufferP2，通过大力翻转反应管管4—6次，彻底混合，在室温（15-25°C）反应5min。不要剧烈震荡，这将导致基因组DNA的污染。裂解物出现粘性。不允许裂解反应持续超过5分钟。在使用后，bufferP2的瓶子应立即关闭以避免空气中CO2中和NaOH。如果LyseBlue已添加到buffe

5、rP1，bufferP2加入后将会变成蓝色细胞悬浮液。翻转后应为蓝色均匀悬浮。如果无色区域或褐色细胞块是仍然可见，继续翻转直至达到均匀蓝色。在反应时间准备QIAfilterCartridge（桶管）：将盖子拧到QIAfilterCartridge喷嘴上。将QIAfilterCartridge放在一个方便的架子上。6.添加▲4毫升或●10毫升冷bufferP3，立即通过翻转倒置4—6次彻底地混合直接转到步骤7。不做冰浴（与标准中提不同）。冰冻的bufferP3增强反应效率。bufferP3使蓬松的白色裂解产物变得不那么粘。沉淀的材料包含基因组DNA、蛋白质、细胞碎片和KD

6、S。裂解物应彻底混合确保钾十二烷基硫酸盐沉淀。如果混合物仍会出现粘稠，需要更多翻转混合。如果已使用了LyseBlue试剂，混合直到所有蓝色的痕迹都消失。7.反应物全部倒入QIAfilterCartridge。在室温下(15-25°C)静置10分钟。不要插入柱塞!重要：这10分钟孵化在室温是必不可少的。含蛋白质、基因组DNA和洗涤剂沉淀将浮于上层。这可确保过滤时无堵塞。如果10分钟后沉淀没有漂浮到顶部，仔细用无菌吸管头吸取下面的沉淀。8.竖直放置▲QIAGEN-tip100或●QIAGEN-tip500，加入▲4毫升或●10毫升QBTbuffer，使其自由流空。9.移除Q

7、IAfilterCartridge喷嘴处的盖子。轻轻地插入柱塞到▲QIAfilterMidi或●QIAfilterMaxiCartridge，挤出裂解产物到。直到所有的裂解产物的通过QIAfilterCartridge，不要用太大的力量。大约可以得到▲10毫升和●25毫升的裂解产物。☞取▲240µl或●120µl裂解物为并保存分析凝胶（示例1）确定增长和裂解条件是否最优。10.让裂解产物自由流下QIAGEN-tip☞取▲240µl或●120µl流出的液体取样和保存为分析凝胶（示例2）以确定DNA绑定到QIAGEN树脂的效率。11.加入QI