质粒中提中文版(Omega).doc

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1、中提质粒步骤材料准备：灭菌250或500mL三角瓶，托盘天平，5mL移液枪及枪头，卫生纸，废液缸，记号笔，50mL圆底离心管，15mL尖底离心管步骤：1.集菌将100mL菌液分批倒入50mL圆底离心管中，室温12000rpm离心1min，弃流出液体，打开盖倒置吸水纸上控干。2.加入2.5mLsolutionI（提前加入RNase，4℃保存），重悬细菌沉淀（可使用5mL移液枪吹打）。3.加入2.5mLsolutionII，轻柔混匀（颠倒离心管7-10次），以获得清亮的裂解物，室温静置3-5min。（此步主要是碱

2、裂解细菌，使其中的蛋白质和DNA变性，反应时间不能太长，否则容易使大肠杆菌的基因组DNA断裂成小片段，污染质粒DNA）4.加入1.25mLBufferN3，轻柔混匀（颠倒离心管7-10次），直至形成白色沉淀，室温静置2-3min。5.4℃12000rpm离心10min，使白色沉淀沉于底部。6.取出一个LysateClearanceFilterSyringe，抽出活塞，小心将5中液体全部转移至注射器中（注射器可不放活塞直接直立于4中的离心管中，液体不会出来），室温静置2min。7.将6中注射器放置于一新的15m

3、L离心管，轻推注射器活塞，使液体流入离心管中。8.加入0.1倍体积的ETR（约600uL）至过滤后的液体中，混匀（颠倒离心管7-10次），冰浴20min，期间颠倒离心管几次。（此期间准备一个Hind-BindDNAmidiColumn加入2mLGPSBuffer，室温静置10min，4000rpm离心5min）9.42℃温浴5min，溶菌液变浑浊，室温4000rpm离心5min，则ETR沉入底部。10.小心将上层液体转移至一新的15或10mL离心管中，加入0.5倍体积的EtOH（约2.5mL），轻柔混颠倒5-

4、6次，室温静置2min。11.将10中液体加入柱子中，室温4000rpm离心5min，弃液体，重新装好柱子，直至液体全部滤过。12.加入3mLBufferHB，室温4000rpm离心5min，弃液体。13.加入3.5mLDNAWashBuffer，室温4000rpm离心5min，弃液体。14.重复1315.空甩洗脱柱，室温4000rpm离心15min。16.将结合柱置于一新的15mL离心管中，60℃温箱干燥10-15min。17.加入250uLElutionBuffer，室温静置2-3min，室温4000rp

5、m离心10min。1.将洗脱下来的液体置于新的1.5mL离心管中，做好标记，测浓度并保存。