质粒浓缩步骤.doc

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1、质粒浓缩：Vml①Vml1×TAE或水②2Vml③混匀④离心，最大转速10min⑤取上清⑥1/10VmlNaAc（pH5.2）⑦4Vml冰醋酸⑧置于-20℃，10min⑨离心，最大转速10~15min10.弃上清11.70%酒精洗两次（最大转速），酒精要吸干（离心两次，第一次倒干净，第二次空转吸净）12.室温晾干13.水溶，计算好体积，与加入的其余物质吻合1.加入1/10体积的乙酸钠（3mol/L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3mol/L；2.加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟；3.12,000g离心1

2、0分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4.加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；5.于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；6.加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。浓缩原理：首先，向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc，混匀后，整个体系的Na+浓度就是0.3M（生理盐水的Na+浓度大约为0.15M）。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面，屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则的话，PO4-彼此排斥，DNA就不容易聚集。接着，向整个体系添加2倍体积的无水乙醇

3、。乙醇和水的互溶性很好，加进去后，乙醇就把DNA表面的水膜夺走。换句话说，水和乙醇混去了，原本溶解在水中的DNA只好被挤了出来。第一步加入的Na+平衡了PO4-的电荷，被挤出来的DNA就轻易堆积在一起了。经过离心（12,000rpm×5min），被挤出来的DNA就全部被甩到了离心管底部。把上清倒掉，剩下DNA。然而，这时的DNA不纯，还混有酶切体系留下来的盐分，以及变性了的酶。酶变性了，量也不多，不用清除。向离心管中加入足够量的70%乙醇。这时候，既有足够的乙醇保证DNA不溶于水，又有足够的水把盐份从DNA沉淀里溶解出来。你可以选择短暂离心，或者静置1分钟，来溶解盐分

4、。然后，去干净上清，这样剩下的DNA就不含多余的盐分等杂质，从而不会影响后续实验。把沉淀烘干，最后用适量的水（或者TE溶液，tris保持弱碱性；EDTA螯合金属离子，抑制依赖于金属离子的DNAse；这样的DNA溶液质量更高）溶就可以了。