核苷二磷酸激酶A亚基纯化、鉴定及其对 顺铂抗癌作用增强

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1、中国药理学与毒理学杂志２００３年２月；１７（１）：４０－４３·４０·ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００３Ｆｅｂ；１７（１）：４０－４３核苷二磷酸激酶Ａ亚基的纯化、鉴定及其对顺铂抗癌作用的增强王一飞，邢少王景，张美英，钱垂文，林锋，罗勇，李久香（暨南大学生物医药研究开发基地，广东广州５１０６３２）摘要：目的了解核苷二磷酸激酶Ａ亚基（ＮＤＰＫＡ）验表明细胞中，ｎｍ２３Ｈ１的表达能增强卵巢癌、乳腺能否提高顺铂的抗癌效果。方法利用十二烷基硫癌等肿瘤对顺铂的敏感性［１～３］。作者纯化并鉴定所酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）和Ｗｅｓｔｅｒｎ获ＮＤ

2、ＰＫＡ，采用噻唑蓝（ＭＴＴ）药敏试验探讨ＮＤＰＫ印迹杂交来监测和鉴定目标蛋白ＮＤＰＫＡ，利用离Ａ在体外对肺癌细胞ＬＡ７９５、人喉癌细胞Ｈｅｐ２的作子交换、亲和层析结合高效液相色谱纯化分离目标用及其联合顺铂对两株肿瘤细胞的协同杀伤作用，蛋白；ＭＴＴ比色法测定药物对细胞生长抑制率的影探讨ＮＤＰＫＡ与顺铂联用对肺癌细胞、人喉癌细胞响。结果获得ＮＤＰＫＡ单体蛋白，酶比活为８Ｈｅｐ２的作用。－１·ｇ－１蛋白质；细胞生长抑制率显示，ｍｍｏｌ·ｍｉｎＮＤＰＫＡ单独处理细胞时未见明显的细胞毒性，但１材料与方法与顺铂联合处理却能大大加强后者对鼠肺腺癌细胞ＬＡ７９５和人

3、喉癌细胞Ｈｅｐ２的细胞毒性。结论１．１药品与试剂ＮＤＰＫＡ与顺铂联用能增强顺铂对体外培养的鼠肺分离纯化蛋白ＮＤＰＫＡ的阴离子层析填料腺癌细胞ＬＡ７９５和人喉癌细胞Ｈｅｐ２的杀伤作用。ＤＥＡＥ购自美国ＢｉｏＲａｄ公司；亲和层析填料关键词：核苷二磷酸激酶类；顺铂；癌，ＬＡ７９５；癌，ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ３ＧＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ购自Ｓｉｇｍａ公司。免Ｈｅｐ２；化学治疗疫弗氏完全佐剂，ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司；顺铂，锦州九泰药业有限公司；细胞培养基ＲＰＭＩ１６４０，美国ＨｙＣｌｏｎｅ中图分类号：Ｒ９６３公司；小牛血清，杭州四季青公司；ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ公司。

4、文献标识码：Ａ１．２细胞株（工程菌）文章编号：１０００３００２（２００３）０１００４００４工程菌ＤＨ５αｐＢＶｎｍ２３Ｈ１和人喉癌Ｈｅｐ２细胞由广州暨南生物医药研究开发基地保存，鼠肺腺癌常见的实体瘤如肺癌、肝癌、宫颈癌等大都对化ＬＡ７９５细胞购自军事医学科学院。疗药的反应较差。近年来发现，许多化合物体外能１．３ＮＤＰＫＡ的鉴定、分离、纯化及抗血清效价测定增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。ｎｍ２３Ｈ１被认裂解工程菌ＤＨ５αｐＢＶｎｍ２３Ｈ１，连续离心为是一种癌转移抑制基因，其编码的蛋白核苷二磷（１００００×ｇ，３０ｍｉｎ），取上清，１５％ＳＤＳＰＡ

5、ＧＥ电泳。酸激酶Ａ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｋｉｎａｓｅＡ，ＮＤＰＫＡ），然后将蛋白从凝胶转移至硝酸纤维膜上，洗涤，封与细胞增殖分化有关。ＮＤＰＫＡ与化疗药物结合使闭，加抗ＮＤＰＫＡ一抗，洗涤，封闭，加酶标二抗，洗用对体外培养的癌细胞的作用，到目前为止，尚未见［４］涤，显色，加Ｈ２Ｏ终止反应。拍照。有关报道。顺铂（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）是一种常用的化疗药，工程菌发酵所获菌体经破碎，离心（１８０００×ｇ，特别是对于肺癌、黑素瘤等肿瘤有明显疗效。有实１５ｍｉｎ），取上清过阴离子交换层析ＤＥＡＥ，收集到的溶液再上ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ３ＧＡＳｅｐｈ

6、ａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析收稿日期：２００１１１０５接受日期：２００２０８２９柱［５］，最后排阻ＨＰＬＣ纯化［６，７］，获得纯的ＮＤＰＫＡ单基金项目：国家十五８６３项目（２００１ＡＡ２１５０４１）；广东省体蛋白，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定ＮＤＰＫＡ的活性［８］。ＮＤＰＫＡ科委重大攻关项目（Ａ１０９０２０７）免疫新西兰大白兔［４］，ＥＬＩＳＡ法测定抗血清效价［９］。作者简介：王一飞（１９６３－），男，河南人，医学博士，副［１０］教授，从事中药化学、药理、基因工程药物研究。１．４ＭＴＴ法检测癌细胞生长抑制率８－１联系作者Ｔｅｌ：（０２０）８５２２３４２６，Ｆａｘ

7、：（０２０）８５２２２７０６将终密度为５×１０Ｌ对数生长期的细胞接种３０９，Ｅｍａｉｌ：ｔｗａｎｇｙｆ＠ｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ于９６孔细胞培养板，每孔１００μＬ，３７℃，体积分数为中国药理学与毒理学杂志２００３年２月；１７（１）·４１·５％的ＣＯ２孵箱中培养２４ｈ。设５组，空白对照组（不加任何液体），阴性对照组（不加药物），ＮＤＰＫＡ组（终浓度为０．４，０．２，０．１，０．０５和０．０２５ｇ·Ｌ－１），顺铂组（终浓度为２，１，０．５，０．２５和０．１２５ｇ·Ｌ－１）和ＮＤＰＫＡ＋顺铂组，顺铂的终浓度同顺铂组，－１（肺癌细胞）或ＮＤＰＫＡ的终浓度均为０．０