哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增

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1、实验二、哺乳动物组织DNA的快速分离与基因的PCR扩增主讲教师：周建林、刘如石、韩梅一、实验目的1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总DNA的原理与技术，为PCR分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究打下基础；2、学习与掌握PCR扩增基因的原理和操作方法，了解PCR基因扩增技术在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。二、实验原理1、哺乳动物组织DNA的提取：在EDTA（鳌合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用

2、蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽提纯化。污染的RNA通过RNase消化去除。根据本方法制备的哺乳动物DNA约20～50kb，适于作PCR反应的模板。DNA产量在0.5～3.0μg/mg组织之间。2、多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术：ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（d

3、enaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。模板DNA在94℃条件下变性形成单链；在55℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；70℃下在耐热性DNA聚合酶Taq酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标DNA都以２n次幂扩增，30次循环后目的DNA的量增加106～7倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。要达此

4、目的PCR反应要注意以下问题：①、DNA模板：反应中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA纯度较高，以增加反应特异性。②、dNTP:反应体系中达100μM～200μM。③、Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低；④、引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右，Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间，引物内部不能有回文序列，引物３’端不能互补；⑤、Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在95℃时30min还有50％活力；⑥

5、、变性温度：在93～95℃之间使模板充分变性。⑦、复性温度：55℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。⑧、延伸温度：70～72℃左右，为Taq酶最适反应温度。三、实验仪器、材料与试剂1、实验仪器与材料：台式高速冷冻离心机，恒温水浴，真空泵，PCR仪，台式冷冻离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统，凝胶成像系统，冰箱、微量移液器、组织匀浆及，制冰机，一次性使用塑料手套和乳胶手套，猪肝组织。2、实验试剂：细胞裂解缓冲液：10mMTris-Cl(pH8.0),1mMEDT

6、A(pH8.0),0.1%SDS，70%乙醇，异丙醇，醋酸钾(pH=4.8)(60ml的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O)，TE(pH8.0)或无菌水，无DNase的RNaseA(10mg/ml)，蛋白酶K(20mg/ml)；TaKaRaTaq(5U/l)，10×PCRBuffer(Mg2+Plus)，dNTPMixture(each2.5mM)，猪肝基因组DNA，引物（ForwardprimerandReverseprimer)。四、实验操作步骤（一）、猪肝组织DNA的抽提1

7、、切下10-20mg组织，在液氮中碾磨成粉末。2、将粉末转入1.5ml离心管中，加0.6ml细胞裂解缓冲液和3μl蛋白酶K，混匀，置于55℃水浴中3h以上,但不要超过16h。3、消化液降至室温，然后加入2μl无DNase的RNaseA，混匀。37℃水浴中放置0.5h。4、将样品降至室温，加入200μl醋酸钾溶液，剧烈震荡20s使其充分混合。冰上放置5分钟。5、12000rpm离心5分钟（4℃）。6、将上清液转移到一个新离心管中，加0.6ml异丙醇。充分混匀，12000rpm离心5分钟（4℃）。7、去掉上清

8、，加入0.6ml70%乙醇。颠倒离心管数次，12000rpm离心1分钟（4℃）。8、去掉上清，空气中干燥DNA沉淀15分钟。9、将DNA沉淀溶解于100μlTE或水中。10、浓度和纯度测定：OD260/OD280=1.8-2.0；1OD260=50μg/ml（二）、PCR扩增基因片断：1、设计PCR反应程序94℃预变性2min后开始以下循环94℃30sec49℃30sec20cycles72℃30sec72℃5min；4℃冷却