萼脊兰EF1α基因的克隆及序列分析论文答辩

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1、萼脊兰EF1α基因的克隆及序列分析答辩人:学号:指导老师：日期：2015.05.12主要内容研究背景及意义材料与方法结果与分析讨论致谢研究背景及意义萼脊兰(Sedireajaponica)是兰科(Orchidaceae)萼脊兰属(Sedirea)植物，附生草本，茎短，具数枚叶，叶二列，稍肉质或厚革质，总状花序，疏生数朵花。萼脊兰的花小而素雅，其花色典雅且具有迷人的芳香，观赏期较长，养护简单，且耐寒，故深受人们的喜爱。因此，萼脊兰越来越受到大家的关注，成为了大家研究的热点。研究背景及意义研究背景及意义EF1α是一个主要的翻译延伸因子

2、，调控蛋白质的翻译过程，基因表达及调控非常保守，在真核生物体内属于数量较多的一类蛋白。翻译延伸因子除了在蛋白翻译过程发挥作用外，还具有很多其他的功能，是一种多功能蛋白因子。在很多植物中都能够通过克隆得到，但还没有从萼脊兰中分离出来，本实验期望克隆萼脊兰EF1α基因序列并对其进行分析，为以后进一步的研究以及相关基因的研究分析奠定基础。材料与方法按照NCBI中登录的植物翻译延长因子同源核苷酸保守序列设计简并引物，EF1aF:ACATCAACATCGTGGTCATTGG，EF1aR:GCCCTTGTACCAGTCAAGGTTG。以萼脊兰

3、叶片作为实验材料，采用Trizol法提取萼脊兰总RNA,并利用RT-PCR技术克隆翻译延伸因子—EF1α。运用DNAMAN、Primer5.0对EF1α基因进行剪切和简单分析，利用在线网站NCBI、ExPaSy-Protparam、nps@、SWISS-MODEL等对EF1α编码的蛋白进行同源序列的比对和结构域以及模体的分析、理化性质的分析、二级结构的分析、三级结构的构建，利用CLUSTALX1．81和MEGA4．0软件进行进化树分析，采用邻接算法进行。结果与分析1.萼脊兰总RNA提取结果RNA条带清晰，且28S条带的亮度大约是1

4、8S的两倍，表明RNA无明显降解，可用于逆转录cDNA结果与分析2.PCR产物鉴定结果显示条带清晰无拖尾现象，在500bp-750bp之间，推测所克隆的基因为所需基因结果与分析3.凝胶回收检测条带的亮度和所点的Marker的亮度差不多表明回收结果不错，可以进行下一步的实验结果与分析4.菌液阳性克隆鉴定有条带且亮度清晰无拖尾现象，大小约620bp,可以送去测序结果与分析5.测序结果结果与分析6.蛋白二级结构α-螺旋（Alphahelix）占39.81％,β-转角（Betaturn）占10.68％，延伸链（Extendedstrand

5、）占21.36％，无则卷曲（Randomcoil）占28.16％结果与分析7.蛋白三级结构利用SWISS-MODEL对EF1α编码的蛋白进行三级结构的预测，与ELONGATIONFACTOR1-ALPHA2的相似性最高达81.07%，以ELONGATIONFACTOR1-ALPHA2（4c0s.1.A）为模型构建。结果与分析8.亲水性/疏水性有多个亲水区域，多数氨基酸属于亲水氨基酸，因此属于亲水蛋白。结果与分析9.进化树由于延伸因子表达比较稳定，近几年来在许多文献中都有以EF1α作为植物重要的内参基因来研究，而在萼脊兰相关基因的研

6、究中，还没有对萼脊兰内参基因的研究，本文研究克隆了萼脊兰的EF1α片段填补了这一空缺，为对萼脊兰内参基因的筛选奠定了基础。本文并没有对延伸因子EF1α是否能够成为萼脊兰生长发育和生理过程的内参标准进行研究，这是我们应该进行更深一步研究的内容。讨论大学本科的学习生活即将结束。在此，我要感谢所有曾经教导过我的老师和关心过我的同学，他们在我成长过程中给予了我很大的帮助。本文能够顺利完成，要特别感谢我的导师蒋素华老师，感谢袁老师以及其他老师的关心和帮助。最后向所有关心和帮助过我的人表示真心的感谢。致谢