低强度超声波对辐射后体外培养成骨细胞影响的实验研究

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1、中山大学硕士学位论文低强度超声波对辐射后体外培养成骨细胞影响的实验研究姓名：吴少伟申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：沈强2003.5.18!里望星塑重鎏型堡堑亘堕!!堡量壁量塑塑整堕塑墨堕丛至!墨堕墨低强度超声波对辐射后体外培养成骨细胞影响的实验研究专业：口腔临床医学硕士生：吴少伟指导老师：沈强主任医师摘要f当前，放疗技术已被广泛应用于肿瘤及其他疾病的治疗中，由于骨骼分布的、特点，放疗计划实施过程中骨组织都可能被照射，引起骨组织的放射性损伤，主要表现为放疗后骨质疏松及其引起的骨折和放射性骨坏死。处于放射

2、性损伤状态的骨组织发生创伤常发生延迟愈合，甚至不愈合。成骨细胞是骨创伤修复、重建的最关键细胞。它能分泌胶原、糖蛋白等骨基质及骨形成蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等细胞因子促进骨及周围组织的修复、重建。研究表明，骨组织受到辐射后，局部成骨细胞的数目减少及功能下降。辐射引起的局部成骨细胞数目下降及功能受损是放疗后骨创伤延迟愈合或不愈合的重要原因之一。低强度超声波(10w—intensityultrasound，LIUS)是一种带机械能的声波，能促进损伤组织的修复。动物及

3、临床实验证明，LIUS能使新鲜骨折(freshfracture)的愈合时间提前40％。近年来，也有学者把LIUS用于放射性骨坏死和各种原因引起的骨延迟愈合及牵张成骨固定期的治疗中，均取得较好疗效。LIUS促进骨创伤愈合的确切机制尚不完全清楚。推测LIUS对成骨细胞的直接促进作用是LIUS促进骨创伤愈合的机制之一。已有学者证明LIUS能促进体外培养成骨细胞的增殖及功能分化。但对于辐射后的成骨细胞，LIUS的效应如何，尚未见有文献报道。鉴于此，本实验用LIUS作用于Y射线辐射后体外培养的成骨细胞，以探讨篮塑星黧至婆塑碴

4、墅亘缝笠量茎壁曼塑墅墼堕塑塞墅坚蜜尘塞塑墼tLIUS在放疗后骨创伤愈合过程中的作用。斗目的，({{探讨电裹疆袈对钵羚培莽残雷缨飘荐涯及功§1分化麴影硪。f2)检测LIUS对辐射后体外墙养成骨细胞增殖及功能分化的影响。∞)探讨LIUS对辐菇麓体箨臻券成餐缀鼹产雯俸爱静辖袈赛镶。材料魑方法1．细胞获取：采用双重酶消化法，获取SD大鼠乳鼠的类成骨细胞。乳鼠龄3～5天，恶蔻条件下取毫箕颊骨，去滁软缎织，经簇酶及I}墼黢愿簿瀵纯爆获褥。2．细胞的纯化及培养：细胞的纯化采用差速贴壁法纯化。细胞培养在含15％小争盘潘翡RPMll

5、640培养滚中，在5％C02、37。C僵瀑培养褡中培养，缁怒予24小时后大部分贴壁。根攒细胞生长情况，约3～4天换液～次，细胞铺满瓶底后传代。将第3代细脆薅予实验。3。细胞的鉴定：鉴定的指标为：细胞的形态、碱性磷酸酶(ALP)合成、骨钙索(OCN)分泌和体外成骨(锊结节)的形成。细胞的形态通过光学相差倒置显微镜观察。ALP定性捡测通过缎织化学染色法，怒察细胞爬片中ALP的阳性情况。OCN通过所购放免试剂盒通道放射免疫法检测。体外钙结节形成通过莆素红一s染色法麴戳确寇。以上箍定与成绎臻缨腿送行对照。4．细胞的辐射：将

6、第2代细胞传代，调整细胞浓度，置入六孔板中，并随机分缝。传代着嚣天进行4令裁量麴￥射线辐骞雩，裁量分掰为lOOcGy、300eGy、600cOy、900cGy,以不受辐射(O，0cGy)为对照组。辐射后的细胞立即换液并继续培养。5．低强度超声波的于预：采用的低强度超声波机为比利时产phiomed型超声波桃。其有关参数如下；频率：1．0MHz脉冲：l：5强度：100mw／cm2处理时间：于细胞辐射后24小时、36小时各处理一次，每次3分钟6。捂稼捡滚：彀LIUS筵理蔗0、2、4、6、8天的缩麓、第3，6，9，12天低

7、强度超声波对辐射后体外培养成骨细胞影响的实验研究中文摘要细胞培养上清液及培养6天的细胞爬片进行检测。检测的指标为细胞数量、ALP活性、OCN量及I型胶原分泌量。细胞数量用MTT法检测获得，ALP活性通过对硝基苯酚比色法获得，OCN通过OCN试剂盒放射免疫法(RIA)获得，I型胶原的分泌量通过全自动图像分析检测细胞爬片上I型胶原的免疫组化染色光密度获得。7．结果用均数及标准差来表示，用统计分析。比较分析均采用方差分析法。结果SPSSI1．0统计软件对所获得的数据进行a=0．051．细胞增殖情况的测量电离辐射对大鼠成骨

8、细胞(Rat’SosteoblastsROB)的存活和增殖有抑制作用，并呈现出剂量依赖性。LIUS可一定程度上促进辐射后细胞的增殖。对于300cGy及其以下剂量的辐射，这种效应表现很明显，尤以0cGy组和100cGy组为甚。300cGy时，LIUS仍能促进ROB的增殖，可使细胞较早恢复到指数生长期。当辐射剂量达到600cGy时，ROB的损伤严重，LIUS的促