低强度脉冲超声干预对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响

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1、低强度脉冲超声干预对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响　　低强度脉冲超声(lom3大小，再放入预先装有10ml、0.2%Ⅱ型胶原酶的25cm2培养瓶内，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内过夜，次日收集消化液于15ml离心管内，1500r/min离心8min，弃上清液，加入适量完全培养液重悬后接种至25cm2的培养瓶内，静置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养，每2～3d换液1次，待细胞铺满瓶底70%～80%时进行传代培养。　　1．4软骨细胞的形态学观察与鉴定　　1．4．1形态学观察倒置显微镜下逐日观察体外培养软骨细胞的形态变化、生长情况，并及时摄片记录。　　1．4．2甲苯

2、胺蓝染色取第3代软骨细胞，用完全培养液制成细胞悬液，调整细胞密度为1105/ml，按每孔2．5ml将细胞悬液接种至预先置有经多聚赖氨酸处理过的盖玻片的6孔培养板内，制作细胞爬片。常规培养3d后，弃掉培养液，PBS洗3次，常温晾干;用4%多聚甲醛固定盖玻片1h;吸弃多聚甲醛，PBS漂洗3次，常温晾干;加1%甲苯胺蓝浸染2h;去除多余染液，自来水浸洗1min，无水乙醇迅速脱水;镜下观察，满意后晾干，中性树胶封片，拍照。　　1．5细胞分组及LIPUS干预取第3代软骨细胞悬液，调整细胞密度为1105/ml后置于8个35mm培养皿内，每皿2ml，随机分为空白对照组及3种不同强度

3、的LIPUS组，超声强度分别为40、50、80mHz，脉冲重复频率:1.0KHz，脉冲宽度:200μs，作用周期:50。空白组置于探头下但无超声照射，各LIPUS组每日超声辐照20min，连续照射3d。　　1．6检测指标　　1．6．1CCK-8法检测软骨细胞增殖情况干预3d后，消化收集培养皿细胞，全培重悬后，以每孔100μl细胞悬液，接种于96孔培养板内，每组6个复孔，同时取6孔加入不含细胞的完全培养液作为调零组;向每孔加入10μl的CCK-8溶液，将培养板放入培养箱内孵育3h后，于酶标仪上450nm处测各组光密度值(opticaldersity，OD

4、)。　　1．6．2Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色收集培养皿内细胞，置于6孔板内制成细胞爬片，待细胞完全贴壁后倾去培养液，0.01mol/LPBS漂洗3次;4℃、4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗;3%H2O2浸泡10min，PBS漂洗;0.3%Triton100通透30min，PBS漂洗;山羊血清覆盖盖玻片10min;滴加适量Ⅱ型胶原免疫组化一抗，覆盖玻片4℃过夜，PBS漂洗;滴加适量二抗滴覆盖10min，PBS漂洗;加人适量链亲和素标记HRP，孵育10min，PBS漂洗;加入DAB染色液覆盖玻片10min，自来水漂洗;苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，

5、显微镜下观察、摄片。　　1．7统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析，数据以珋x±s表示，采用单因素方差分析及Duntt、LSD法比较，检验水准α=0.05。　　2、结果　　2．1形态学观察倒置显微镜下见原代培养软骨细胞接种24h后，大部分细胞贴壁，呈短梭形或不规则状，见图1;48h后，细胞逐渐展开，呈三角形或不规则多角形;培养3d后，细胞数量明显增多。5d时，细胞铺满瓶底80%～90%，单层细胞成片生长，呈铺路石状，见图2。传代培养细胞贴壁时间较原代细胞稍短，大部分可在8h内即贴壁，生长速度也较快，3～4d即可传代。前3代细胞生长速度

6、较快，形态较稳定，而当培养至第4代时，部分细胞呈长梭形生长，开始去分化，且随传代次数增多呈递增趋势。　　2．2甲苯胺蓝染色甲苯胺蓝能使细胞中的蛋白多糖等酸性黏液物质变为深蓝色，核酸及其他物质(如细胞核)呈紫红色。本研究培养出的软骨细胞经甲苯胺蓝染色后，镜下清晰可见细胞外基质中散在分布着深蓝色的异染颗粒，大部分细胞的胞核被染成紫色，见图3。　　2．3不同强度LIPUS对软骨细胞增殖的影响不同强度LIPUS照射3d，CCK-8法检测所得各组软骨细胞OD值经单因素方差分析显示，各组软骨细胞增殖差异不全相同(F=12.433，P＜0.01)。Duntt法比较显示50、80mHz

7、、脉冲重复频率1．0KHz的LIPUS直接作用于动物模型患处28d，发现LIPUS能够促进Ⅱ型胶原分泌，从而保护关节软骨。Korstjensetal发现LI-PUS能促进体外培养人软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达。张迪等研究发现LIPUS能够提高SD大鼠前软骨干细胞的细胞外基质Ⅱ型胶原、转化生长因子β1及Sox9基因mRNA的表达。对其作用机制，众学者也是各抒己见。有研究指出LIPUS能够促进TGF-β1、BMP-2、BMP-4、FGF-7、TGF-βR1、VEGF等细胞因子的合成，从而发挥生物学效应。　　周崑等