低强度脉冲式超声波促进兔关节软骨缺损修复的实验研究

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1、120第二届国际创伤骨科高峰论坛(1SFOT)2lmIn№mmionsJSumnlJtE佣岫lfer岫hn螂*cTraumaPi03u低强度脉冲式超声波促进兔关节软骨缺损修复的实验句}究也疗王彦丽王秋根唐吴陆晴友汤旭13吴剑宏上海第二军医大学附属长簿医院骨科200433【摘要】目的对低强度脉冲式超声波(PLI．us)在全厚关节软骨缺损修复中的作用进行研究，探讨其作为一种非侵入性的手段在关节软骨损伤修复和延缓退变中的应用。方法成年雌性新西兰兔24只，在双侧股骨髁部钻孔形成直径3．5mm、深5nm的缺损。每天对左膝给予20min强度为30mW／em2超声波治疗，右膝做空白对照

2、。在术后2，4，8，12周随机抽取6只动物取材，用大体评分龃织学和免疫组化、特殊染色等方法评估治疗效应。结果超声组修复软骨的形态学和组织学特性优于对照组。ABPAS染色提示超声组新生关节软骨的蛋白多糖含量高于对照组，lI型胶原免疫组化提示，超卢组较对照组得到更早的，更好的修复，更少的退化性改变。结论低强度脉冲式赳声促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，对关节软骨修复有积极作用。【关键词】低强度脉冲式超声波；关节软骨；软骨损伤；lI型胶原；蛋白多糖关节软骨在疾病和创伤后的自我修复能力低下，当前的治疗方法效果有限。应用低强度脉冲式超声波(PIJlsedlow—intensityUlt

3、rasound．PL／US)的骨折愈合超声治疗仅(SonicAcceleratedFractureHealingSystem，SAFHS)，在临床上应用于治疗新鲜骨折和骨不连，取得良好疗效1。PI．[US频率仍为临床理疗常用的1．5M14z，但强度降低到30mw／cm2，并通过脉冲式发生进一步减少了热效应，保留了其机械效应对骨与软骨组织的作用。研究发现PLIUS加速骨折愈合的机制为促进软骨内骨化和基质合成2，本课题将P1．IUS引入关节软骨损伤修复，探讨其作用机制，为这种经济安全和非侵入性的方法在骨与关节损伤及退变的治疗等领域的应用提供理论依据和技术支持。材料和方法一、实

4、验材料1．实验动物：12月龄新西兰兔24只，雌性，体重2kg。由第二军医大学实验动物中心提供。2．主要试剂：羊抗兔II型胶原多克隆抗体(I：50，Santac11Iz公司)；鼠抗X型胶原多克隆抗体(1：50，SantacnE公司)；生物素化抗羊和抗鼠IgG(北京中山公司)；Streptavidin—HRP(北京中山公司)；0．4％胃蛋白酶(sigma公司)；DAB(Sigama公司)；阿尔辛蓝染色液：阿尔辛蓝8GSlg，冰醋酸3ml，蒸馏水97rn!。用前过滤，在溶液中加入麝香草酚2粒防腐。PH值为2．6～3．00之间。3．主要仪器：CSL2型超声波发生器(上海大沪医疗器

5、械厂定制)；标准超声功率计(常州计量局实验工厂)；TK—C1380型彩色数码摄像机(日本JVC公司)。二、实验方法1．动物模型的建立：分别构建兔双膝关节软骨缺搅模型，共48个实验关节。通过髌骨旁人路，分开膝关节的连接组织，将髌骨向一侧脱位以显露股骨髁问嵴和髌骨沟。使用直径3．5mm的自制钻孔器，在股骨髁间沟处形成深5mm的骨软骨缺损。生理盐水冲洗后，逐层关闭关节囊。术后伤口外涂红霉素眼膏，每只动物每天肌注青霉素G20万u，共5天。分笼饲养，常规进食，自由活动，不做任何外固定。术后3天起，对左膝关节处施加超卢刺激，每口1次。定期褪毛，将超声发生器头固定f膝关节外侧方，以超声

6、耦台剂充分结合。超声组施加20111in低水平的声压，强度为30mW／cm2，频率为1．5MHz，脉冲幅度为200s。对照组给与OmW／cm2的窄向刺激。每个超声装置在实验前都使用超声功率仪检测以确信发出适当的信号。分别于治疗2，4，8，12周后随机抽取6只动物空气栓塞处死并取材。2．大体观察：处死动物后立即解剖膝关节，获取的每个膝关肖缺损处标本，通过双盲法，分别由两人以Moran大体评分标准进行分类3．组织学观察：将获取的每个膝关节缺损处标本，制作成组织切片后，根据Caplan评分标准评分。对治疗组的每一个标本从三个切片独立的通过舣盲法评估。观察者在看了这个标本的所有切

7、片后决定组织分级。为避免观察错误，取所有观察者的平均值决定此标本的分级。4．H—E染色：股骨下端标本4％的多聚甲醛液固定，固定后标本用EDTA缓慢脱钙。脱钙后的组参I缺损区以其直径一分为二，石蜡包埋，4pm连续切片，常规H—E染色制片。5．II型胶原免疫组化染色(S—P法)：切片常规脱蜡至水，0．3％H’02室温孵育5—10rain后蒸馏水冲洗，PBS浸泡5rain，加胃蛋白酶消化，370c孵育3h后PBS洗；滴加芒抗兔II型胶原多克降抗体工作液，室温1h，37℃孵育30rain后PBS洗；分别滴加抗羊和抗鼠生物素标记的二抗，