mscs与软骨细胞共培养复合ⅱ型胶原支架修复兔关节软骨缺损的实验研究

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1、山东大学硕士学位论文MSCs与软骨细胞共培养复合Ⅱ型胶原支架修复兔关节软骨缺损的实验研究姓名：李涛申请学位级别：硕士专业：外科学（骨外）指导教师：张伟20060508原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责仟由本人承担。论文作者签名：登日期：如6．上笞’关于学位论文使用授权的声明本人完全了解】

2、lJ东人学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许沦文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩E1J或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)⋯一：盟翩虢矾日期：型山东大学硕士学位论文MSCs与软骨细胞共培养复合Ⅱ型胶原支架修复免关节软骨缺损的实验研究硕士研究生李涛导师张伟摘要目的关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病。成熟关节软骨的自身修复能力较差，除’J软骨内无

3、【fⅢ管、缺乏未分化的软骨细胞及软骨细胞被固定在一个致密的由胶原和蛋白多糖组成的固体基质中有关外，可能还与以下两个因素有关：①内在修复依赖于软骨细胞有丝分裂及短期内增加的代谢产物(主要是胶原和蛋白多糖)，而成熟软骨细胞有丝分裂能力极低：②外部愈合依赖于来自软骨下骨的问充质成分的参与，形成新的结缔绢织，经过一系列变化形成纤维软骨。20世纪80年代以柬，组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了前所未有的机遇。人们利用软’胃+组织工程技术，将细胞利支架材料复合培养，修复软骨缺损已经取得了初步成设。本课题

4、研究的目的是采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓删充质干细胞(MSCs)培养、传代后与软骨细胞以7：3混合再与II型胶原支架材料和PLGA复合培养，观察细胞在两种支架材料上黏附、伸展和增殖情况，并观察其存动物实验中修复兔关节软骨缺损的情况。期望能够找到软骨组织’r程理想支架考才料与种子细胞。材料和方法l取3—4月龄健康新西兰大白兔，穿刺抽取双侧胫骨上端骨髓6-8ml，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，进行原代、传代细胞培养。2取3月龄新两兰白兔关节非负重区关节软骨，将软骨片剪成O．3cmxo．3c

5、m大小，以O．2％的II型胶原酶消化810分钟，离心、洗涤、汁数。将细胞接种于50ml培养瓶中，加入10％胎牛血清培养液5ml，在37％、5％C02、湿度饱山东大学硕士学位论文和的培养箱中培养。待细胞生长接近融合后，以0．25％的胰酶消化收集备用。3．取经过培养6天的MSCs和软骨细胞以7：3的比例混合，调整细胞浓度为4x106／ml，与PLGA、II型胶原复合培养7天，进行复合组织的病理形态学观察；动物实验备用。观察骨髓间充质干细胞在PLGA、II型胶原内生长增殖情况．扫描电镜观察II型胶原支架材料以

6、及PLGA的结构、孔隙率和细胞在支架内的黏附和生长情况。4．取3-4月龄健康新西兰大白兔30只，在实验兔的双侧股骨滑车处钻直径4mm，深度4-5mm的骨软骨缺损，深达软骨下区。随机分为2组：A组，15只，右膝软骨缺损处植入混合细胞复合Ⅱ型胶原材料；B组，15只，右膝软骨缺损处植入混合细胞复合PLGA材料；C组，空白对照组，为上述两组的左膝软骨缺损处，不植入任何材料。分别于术后4、8、12周各处死5只动物，进行大体和组织学观察。结果1．细胞形态学改变倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接种后1．3闩可见少量细

7、胞贴壁，呈短梭形。3日后出现细胞集落，7-8日广泛集落形成。12一14日细胞形成单层。传代细胞贴壁快，7-8日形成单层，细胞核大，胞浆内颗粒多。2．组织学观察：细胞在II型胶原支架中分布、生长良好。细胞外基质丰富，可见细胞外基质片状形成，甲苯胺蓝染色显示细胞周围异染性基质。PLGA孔隙率差，复合的细胞较少。II型胶原支架内复合细胞的数量明显高于PLGA支架。电镜观察：扫描电镜显示II型胶原纤维呈网架状结构，孔隙不规则，孔径在100．20011m之间，孔壁厚度较均匀，为20一40IIm，孔隙率大于92％。

8、复合材料显示细胞在lI型胶原支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基质和细胞伪足的铆固作用，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。PLGA孔隙规则，表面光滑，孔径在200—30011m之间，孔壁厚度较均匀，为10．30pm，孔隙率约为82％，细胞黏附欠佳，水容性差，组织相容性不如lI型胶原纤原。3．动物实验结果大体观察：术后12周，A组缺损修复区组织与周围关节软骨相整合良好，软骨缺损区被光滑白色半透明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差