阿托伐他汀对单核内皮细胞黏附的影响及其作用机制的探讨

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1、中文摘要阿托伐他汀对单核一内皮细胞黏附的影响及其作用机制的探讨摘要目的：利用肿瘤坏死因子．a(TNF．a)诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)发生脂质过氧化，通过细胞黏附试验观察阿托伐他汀(ATV)干预后脂质过氧化内皮细胞与单核细胞(U937．)发生黏附的改变，并分别从ATV对HUVEC表面细胞间黏附分子．I(ICAM．1)的表达量及单分子ICAM．1与其配体CDllb相互作用力的影响两方面进一步探讨ATV调脂外的抗炎作用机制。方法：以0．1％I型胶原酶37"C消化15-20min人脐静脉内皮，分离获得的原代tKJ-VEC用低血清内皮细胞专用培养基培养，3

2、7℃、5％C02孵箱内培养至融合后传代；用VIII因子相关抗原鉴定HUVEC，将第2．3代细胞用于实验。1单核．内皮细胞黏附试验将HUVEC接种于96孔板，分组实验：①．Control(对照组)；②T】师一a(TNF-al0ug／L)；(要)．TNF—a+ATV(TNF-al0ug／L+ATV10lamol／1)。(TNF—a10ug／L孵育24dx时后，与ATV共同孵育24小时)。25％RoseBengal染色法检测矾ⅣEC与单核U937细胞黏附情况，酶标仪570nm波长下测定每孔A值，单核细胞摄取的RoseBengal染料在PBS．乙醇作用后释放出来，每孔A值

3、与所粘附的单核细胞数量成正比。2ATV干预对HUVEC表面ICAM．1表达的影响将HUVEC接种至6孔板，分组如上，实验结束收获细胞，将中文摘要细胞悬液转移入流式管内，PBS洗细胞1次，利用剩余上清液制成细胞悬液(约100u1)，每管内加入10ulFITC标记的ICAM。1单克隆抗体，PBS洗细胞3次，流式细胞仪检测每组细胞表面ICAM．1表达，每次记数15000个细胞，结果以平均荧光强度表示。3融合表达载体ICAM．1一GFP的构建及转染COS．7细胞从体外培养的HUVEC中提取总RNA，以pEGFP．N1为模板，设计合成一端含有BamHI酶切位点，另一端将含有

4、HindlII酶切位点的一对PCR引物(上游和下游引物序列如下：ICAM．UPPER：5’CCAAGCTTCCTCGCTArGGCTCCCAGCAGY；ICAM—LOWER：5’CTGGATCCAAGGGAGGCGTGGCTTGTGTGTT3’)，RT-PCR扩增获得ICAM．1eDNA编码区全长序列，并进行DNA测序。将ICAM．1的骗码区eDNA与pEGFP-N1进行酶切，构建GFP与ICAM．1的C末端连接的表达载体并行双酶切鉴定。构建好的质粒ICAM．1．GFP通过脂质体(1ipofectamine2000)介导转染至COS．7细胞，通过激光共聚焦显微镜观

5、察转染后的COS。7细胞是否发出绿色荧光。4AFM测定ICAM．1与CDllb的单分子力谱AFM探针以标准程序清洁后，室温下于MPTMS孵育2小时将其硅烷化。用一段长约20．40nm的聚乙烯二醇(PEG)作为间隔物，其活性胺基末端和活性巯基末端分别连接人重组CDllb蛋白及AFM探针针尖。将质粒ICAM．1．GFP经脂质体介导转染COS．7细胞，分组测力：①不予任何药物干预(TransfectedCell)；②ATVlopmol／l孵育修饰有CDllb蛋白的AFM针尖1小时(Tip+ATV)；③ATV中文摘要109mol／1孵育转染后的COS．7细胞1小时(ICA

6、M．1．CelI+ATV)；④给予抗人ICAM．1单克隆抗体200ug／ml孵育转染后的细胞1小时(ICAM．1．Cell+Anti)。对荧光显微镜下观察各组细胞所获得的ICAM．1荧光融合蛋白聚集区在2．o士O．5x103pN／s的加载速率范围下，令CDllb修饰的AFM探针反复在细胞表面下压一回拉，随机获得力．距离曲线，统计得出针尖和细胞间亲和力的高斯分布及成键几率。结果lTNF．a诱导组HUVEC与单核U937黏附较对照组明显增多(P

7、CAM．1表达量增多(P<0．05)，而A1W干预则下调TNF—a诱导的HUVEC表面ICAM．1表达量的增多(P

8、M一1-C