锌指蛋白zbtb20对巨噬细胞TLR4信号转导的调控作用

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1、摘要本课题研究了锌指蛋白zbtb20对巨噬细胞TLR4信号转导的调控作用。主要构建了zbtb20真核表达载体并建立了小鼠腹腔巨噬细胞的zbtb20干扰模型和小鼠巨噬细胞系RAW264．7的zbtb20稳定表达模型，发现干扰zbtb20的表达可以抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症细胞因子和I型干扰素，并抑制ERK,JNK,P38的活化；以zbtb20基因缺陷小鼠的巨噬细胞为模型进一步验证了该结果。相反，过表达zbtb20具有促进效应。因此，zbtb20是TLR4信号通路的正向调控分子。关键词：锌指蛋白zbtb20、TLR4、巨

2、噬细胞、细胞因子、干扰素、信号通路锌指蛋白zbtb20对巨噬细胞TLR4信号转导的调控中文摘要锌指蛋白zbtb20对巨噬细胞TLR4信号转导的调控作用Toll样受体(Toll．1ikereceptors，TLRs)是一类重要的模式识别受体(PRRs)，因其与果蝇中的Toll基因相似而得名【l邡'4】，其通过识别病原体相关分子模式(Pathogen．associatedmolecularpatterns，PAMPs)而启动免疫应答和炎症反应【5】。目前至少已经报道了11种人Tub和13种小TLRs[6,71。TLR4是最早发

3、现的人TLRt81．LPS与其结合可以启动MyD88(Myeloiddifferentfactory88)依赖的和TRarffmdomainconta／ningadaptorinducinginterferon．13)依赖的信号通路，介导炎性细胞因子和干扰素的产生，以清除外来病原体。但TLRs的过度活化会导致自身免疫病、内毒素休克等免疫病理状态，所以TLRs信号转导中存在着精细的调控机制以保持机体的稳态。锌指蛋白zbtb20(zinefingerandBTBdomaincontaining20)是由本研究团队最早从人树突状

4、细胞eDNA文库中克隆出的一个新的全长eDNA并于2001年率先报道【9J，因其是树突细胞来源的BTB／POZ锌指蛋白，所以当时称之为DPZF(BTB／POZzincfingerproteinderivingfromhumandendriticcells)。早期研究发现其在造血系统特别是免疫细胞中能够比较优势表达。近年来对其所作的研究主要集中于神经系统和肝脏[to,tt,t2,13]，对于其在免疫系统中的功能和作用机制至今还没有报道。本课题对zbtb20在TLR4信号转导中的作用及其相关机制进行了初步的探讨。一、小鼠zbt

5、b20的克隆和表达我们使用小鼠巨噬细胞RAW264．7的eDNA克隆了zbtb20的全长核苷酸序列，并以此序列为模板构建了zbtb20真核表达载体。同时我们用LPS(100ng／m1)刺激小鼠腹腔巨噬细胞观察在不同的时间点zbtb20表达量的变化。定量PCR的结果显示，随着时间的延长，zbtb20的表达量下降，这种诱导性的表达变化提示我们zbtb20有可能在TLR4的信号转导中发挥作用。二、过表达zbtb20对巨噬细胞TLR4信号转导的调控我们将构建的zbtb20真核表达载体转入巨噬细胞系RAW264．7，采用新霉素筛选的

6、方法，得到了zbtb20的稳定表达细胞株，称之为RAW-zbtb20。采用RT-PCR和Westonblotting的方法证实了RAW-zbtb20细胞的过表达zbtb20效果。同时我们利用第二军医大学硕士学位论文此细胞株为模型观察了zbtb20对LPS触发的嘶信号通路的调控作用。百先我们用LPS(100ng／m1)刺激RAW-zbtb20，观察前炎性细胞因子和IFN．B的变化，RT-PCR和ELISA实验证实了zbtb20过表达可以显著提高细胞因子的分泌。同时我们也观察了过表达zbtb20对LPS诱导的巨噬细胞丝裂原活化

7、的蛋白激酶通路(包括ERK、JNK、P38)的影响，结果显示，过表达zbtb20可以明显提高LPS触发的ERK、INK、P38的活化。三、干扰zbtb20表达和zbtb20缺陷对巨噬细胞TLR4信号转导的调控我们用RNA干扰技术设计了zbtb20的siRAN，并将siRAN转入小鼠腹腔巨噬细胞，定量PCR证明其干扰效率可以达到80％；用LPS刺激此细胞，用定量PCR和ELISA检测了细胞因子的变化，结果与过表达zbtb20相反，即干扰zbtb20可以抑制LPS触发的巨噬细胞分泌前炎性细胞因子和删．B。以zbtb20基因缺陷

8、小鼠的巨噬细胞为模型进一步验证了该结果。：综上所述，我们的研究结果表明，锌指蛋白zbtb20参与了巨噬细胞TLR4的信号转导通路并发挥正向调控的作用，其能够促进TLR4触发的前炎性细胞因子和IFN．B的产生。我们的研究对于进一步了解TLR4信号转导的调控机制、了解病原体的致病机理和控制病原感染有一定的理