喹赛多相关锌指蛋白的表达调控与其调节基因的研究

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1、华中农业大学硕士学位论文喹赛多相关锌指蛋白的表达调控与其调节基因的研究姓名：邢丹申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：袁宗辉201206喹赛多相关锌指蛋白的表达调控与其调节基因的盟窒喹赛多相关锌指蛋白的表达调控与其调节基因的研究专业：兽医药理学2012届硕士研究生：邢丹指导老师：袁宗辉教授(国家兽药残留基准实验室(HZAU)／农业部食品安全评价重点开放实验室，华中农业大学中国武汉430070)摘要喹赛多作为喹噫啉类药物的新品种，具有毒副作用小、安全性高、用药后吸收快、消除迅速、无残留等优点，还展示出显著的促生长功能和抗炎活性。为了能够更好的开发利用喹赛多，本实验室

2、对其进行了各方面的实验研究，但是目前对于喹赛多的药理作用机制还不甚明了。本实验室于2008年通过差异显示技术，从喹赛多作用后的猪肝组织中，筛选得到了8个药理作用相关基因，其中包含了锌指蛋白(SZNF)。SZNF是CCHC型锌指蛋白家族成员，能够结合基因的mRNA，在转录后水平发挥转录调节作用。我们推测SZNF可能正是探索喹赛多药物作用机制的一个良好切入口，喹赛多能够通过SZNF的转录调控功能，影响细胞内相关基因的表达，从而展现其促生长功能和抗炎活性。因此研究SZNF可以展示喹赛多在分子水平上的作用路径、调控网络，还能为新药的研发利用、新机制的探索打下良好的理论基础。本实

3、验室已经对SZNF进行了初步研究，但是对于喹赛多如何调控SZNF的表达，SZNF的生理功能和组织分布等问题仍不甚明了，本课题即针对这些问题设计实验进行研究，以探明SZNF介导的喹赛多药理作用分子机制和SZNF的生物学功能。1．PK-15细胞中喹赛多调控SZNF表达的相关信号通路为了探明PK．15细胞中喹赛多调控SZNF表达的分子机制，本课题首先对SZNF表达的相关信号通路进行了研究。实验采用RT-qPCR(Real．timequantitativePCR)技术，检测了喹赛多孵育PK．15细胞后SZNF表达的时效量效关系，发现喹赛多诱导SZNF的上调表达表现出低剂量长时效

4、应和高剂量短时效应，在2扯M喹赛多作用4h时SZNFmRNA水平最高。随后利用喹赛多和信号转导通路特异性抑制剂共同孵育PK-15细胞，通过RT-qPCR和WesternBlot实验，确定了．INK、NF．1cB和JAK2／STAT5B华中农业大学2012届硕士研究生学位论文信号通路是喹赛多诱导SZNF表达的主要调控通路，而P13K／Akt和P38信号通路起着辅助调控作用。在探索PK．15细胞SZNF表达调控通路的时空关系时发现：喹赛多孵育PK-15细胞1h时，TAKl／NF．v,B和JAK2／STAT5B信号通路激活；2h时，除了上述两条信号转导通路，myD88／TAK

5、l&ASKl／JNK&NF．KB信号通路和JAK2／P13K／Akt／NF—KB信号通路也参与进来，协同将细胞信号传递入核，发挥上调SZNF表达的功能。2．猪原代肝细胞中喹赛多诱导SZNF表达的相关信号通路为了明确猪原代肝细胞中喹赛多诱导SZNF表达分子机理，本课题也对SZNF表达相关信号通路进行了研究。实验采用RT-qPCR技术，首先研究了猪原代肝细胞中喹赛多诱导SZNF表达的时效量效关系。结果表明：虽然两种细胞属于不同的组织器官，但是喹赛多诱导SZNF表达的变化趋势一致。随后采用RT-qPCR和WesternBlot技术，检测了喹赛多和信号转导通路特异性抑制剂孵育猪

6、原代肝细胞后SZNF及相关信号通路因子的表达水平，发现JAK2／STATl、P13K／Akt、TGF．[3／Smad3和P38这四条通路是喹赛多诱导SZNF表达的主要调控通路，而JNK和NF．KB信号通路则起到辅助调控功能。在探索上述信号通路时空关系时发现：喹赛多孵育猪原代肝细胞0．5h后，JAK2／STATl，JAK2／P13K／Akt和P13K／Akt这三条信号通路激活；1h时，TGF．13／Smad3，TGF．13／P13K／Akt以及myD88／TRAF2／TAKl&ASKl／P38信号通路也受到喹赛多的诱导而活化，之后这些信号通路协同作用，共同参与喹赛多调控S

7、ZNF表达信号的传递，并在TGF．6／JNKl／2信号通路的辅助作用下，完成了对SZNF表达的调控。3．仔猪体内SZNF的mRNA组织表达谱为了探索SZNF在猪体内的组织分布情况，实验采用RT-qPCR技术，检测了仔猪体内各个组织中SZNFmRNA水平，绘制得到SZNF的组织表达谱。试验结果表明：SZNF在仔猪下丘脑、垂体和骨髓这三个中枢神经系统中表达量最高，其次在肾上腺等具有强大分泌功能的组织中也有较高表达丰度，而在肝脏、十二指肠、肾脏等组织中表达量较低。4．SZNF结合核酸序列的RIP．Seq研究为了探索SZNF能够结合的核酸序列和S