蛋白酶体调节蛋白PA28γ的不同亚细胞定位对肝细胞增殖的影响

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1、洲IlllIIJIlllrl／lllIPrlllllllllllllJY1812970硕士学位论文蛋白酶体调节蛋白PA28T的不同亚细胞定位对肝细胞增殖的影响硕士研究生：王穗海指导老师：李明教授摘要PA28是一种蛋白酶体调节蛋白，它能结合到20S蛋白酶体的外环并促进小肽的降解，这个过程并不需要蛋白的泛素化也不需要消耗ATP，这与PA700不同，后者是一种能识别并降解泛素化蛋白的大分子复合物。目前已经有证据证明，PA28．20S蛋白酶体也能够降解完整的蛋白分子，如HCV-core和SRC．3。这说明PA28．20S蛋白酶体能参与重要的细胞调节过程

2、。PA28T是PA28三种同系物中最保守的一种，而且PA28T主要定位在细胞核中，这与其他两种同系物(PA28a和PA2813)主要定位在细胞质中不同，这可以认为PA28),与其他两种同系物相比存在着很不同的生理功能。Nikaido等人的研究认为，PA28T的表达可能与细胞的转化和细胞的生长调节相关，他们在研究该蛋白时发现，当A31细胞被诱导分裂时PA28T的表达量上升了lO倍。Murata等人通过敲除小鼠的PA28T基因发现，基因敲除小鼠并没有什么明显的生理损伤，但是小鼠的生长速度要比正常小鼠慢，而且体型也没有正常小鼠大，另外，通过培养这种基

3、因敲除的小鼠的胚胎成纤维细胞发现，敲除PA28T基因后的胚胎成纤维细胞的生长速度下降，细胞的饱和密度下降，而且还会阻止细胞周期进入S期。相似地，EMasson等人使用RNA干扰技术抑制了果蝇细胞PA28T的表达后发现，被抑制后的果蝇细胞部分停留在了G1期。另外有报道，PA28T能与PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)形成复合物，而且，PA28T高表达在快速分裂的甲状腺癌细胞中并且核定位明显，这些研究都中文摘要表明，PA28T与细胞的DNA合成以及细胞的分裂存在着一定的关系。一些实验室在对肿瘤凋亡蛋白相互作用

4、蛋白筛选时发现B．Raf,MEKK3、FLASH(CASP8．assosiatedprotein21、Daxx、RanBPM、PIASI等细胞凋亡相关因子均能与PA28T相互作用，而Li研究组在研究乳腺癌细胞时首次发现并证明PA287能．与癌基因SRC．3相互作用并在体内、体外降解这种完整的内源性蛋白(Cell，2006)。随后的研究又发现了几个重要的PA28T相互作用蛋白，包括P21、P16、P19。然而，这些学者在相应的细胞株中高表达PA28T，对目标细胞的周期和生长没有多大影响。考虑到以上报道的PA28T相互作用蛋白都是与肿瘤的促进和抑制

5、相关，我们可以认为，PA28T可能在肿瘤的发生、发展过程中起到重要的双向调节作用。然而，它如何通过调节这么多重要的癌相关基因，从而在肿瘤的发生中发挥作用的，目前还没有明确的研究数据。总的来说，对于PA28T在细胞中的生理功能目前还是模糊的。鉴于很多重要的癌基因在肿瘤的发生过程中会发生重要的突变，于是我们考虑PA28T在癌细胞中的基因是否也会发生重要的突变，从本科室保存的18种正常细胞株和癌细胞株中克隆全长的PA28TeDNA，测序结果显示，PA28T在这些细胞株(正常的和癌的)中并没有发生突变。考虑到PA28T是一种核定位蛋白(这不同于其同系物

6、PA28cc、PA281B定位在胞浆)，但在细胞有丝分裂期(M期)能弥漫表达于整个细胞。我们推测：PA287的不同亚细胞定位对细胞不同时期有着不同的影响，与PA28T对上述重要相互作用蛋白的精细调控密切相关，PA2断通过这种在不同的细胞空间调控不同的蛋白或被不同的蛋白修饰，精细地调控这细胞的生理过程。因此，此次研究从构建PA28T的基因突变体入手，从人胚肾细胞株(293T)中扩增并克隆出PA287cDNA全长序列(自编号KL03-3)，将PA28TcDNA克隆至pMDl8．T克隆载体，在这基础上，对PA28，／cDNA序列进行定点突变和截断，构

7、建了KL03．15(无NLS位点)和KL03．17(无NLS和蛋白酶体结合位点)等突变体，把KL03．3、KL03．15和KL03-17分别克隆到pCDNA3．1(-)Flag哺乳动lI硕士学位论文物表达载体和pDsRed．C3荧光融合表达载体中，KL03．3还克隆到pEGFP．C2绿色荧光融合表达载体中。把鉴定正确的pcDNA3．1(．)KL03．3、pcDNA3．1(-)KL03—15、pcDNA3．1(-)KL03-17分别转染到人肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株Chang，并且通过压力筛选和WesternBlot鉴定，构建了以上两种

8、重组阳性表达细胞系。细胞增殖实验显示，表达KL03．3和KL03．15能促进HepG2的增殖，KL03．15比KL03．3要稍明显，而空载体、pRed