三氯乙烯对人正常肝细胞亚细胞蛋白质组影响的研究

《三氯乙烯对人正常肝细胞亚细胞蛋白质组影响的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：三氯乙烯对人正常肝细胞亚细胞蛋白质组影响的研究Investigationoftrichloroethylene-inducedeffectonsubcellularproteomesinhumanhepaticL-02cells作者姓名：黄爱博指导教师姓名：许华及学位、职称：博士教授学科、专业名称：理学微生物与生化药学学位类型：学术学位论文提交日期：2015年4月20日论文答辩日期：2015年5月26日答辩委员会主席：黄亚东研究员论文评阅人：谢秋玲研究员刘培庆教授学位授予单位和日期：2015年6月30日摘要目的:观察三氯乙烯（

2、trichloroethylene，TCE）对人正常肝细胞（L-02细胞）亚细胞蛋白质组的影响，探讨其潜在肝毒性作用机制。方法：（1）细胞增殖水平的测定及膜蛋白富集的验证。采用CCK-8的方法建立TCE致L-02肝细胞剂量-反应关系，通过SPSS软件计算其半数抑制浓度（IC50）。在IC50确定的基础上，以IC50值倍减的浓度梯度进行TCE染毒，进行细胞增殖实验，以测定细胞的增殖活性。利用ProteoExtractTMsubcellularproteomeextractionkit试剂盒提取膜蛋白组分、核蛋白组分和胞浆蛋白组分。以Na+/K+-ATPase作为膜蛋

3、白的标志物，通过WesternBlot分析膜蛋白组分和胞浆蛋白组分中Na+/K+-ATPase的表达水平，总蛋白组分作为对照组进行膜蛋白富集的验证。以LaminB1作为核蛋白的标志物，同样通过WesternBlot分析其表达水平，总蛋白做对照。（2）2D-DIGE(two-dimensionalfluorescencedifferenceingelelectrophoresis)结合MALDI-TOF/TOF-MS(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)技术分析筛

4、选并鉴定差异表达亚细胞蛋白。具体方法是2.0mmol/L和8.0mmol/LTCE处理L-02细胞后提取膜蛋白组分和核蛋白组分，未经TCE处理的L-02细胞所提取的膜蛋白组分作为对照组，共分成4批细胞提取。提取的膜蛋白组分经过准确定量后，进行荧光标记和双向电泳。获得的图像经过扫描后使用DeCydersoftwarepackage进行分析，寻找到差异表达的蛋白点后进行普通双向考染，接着对考染的胶进行挖胶酶解，最后获得的样品进行MALDI-TOF/TOF-MS鉴定分析，核蛋白组分也按照上述方法进行处理分析。（3）生物信息学分析。通过在线分析软件TMpredprogra

5、m对鉴定出来的膜蛋白组成差异蛋白进行跨膜结构域（transmembranedomain）的预测。STRING数据库构建L-02细胞经过TCE处理与未经过TCE处理差异表达的膜蛋白及核蛋白的相互作用网络。利用DAVID数据库对差异蛋白进行生物I过程富集分析。（4）TCE染毒L-02细胞后差异表达亚细胞蛋白的验证。分别以0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、8.0mmol/L剂量的TCE染毒L-02肝细胞，24h后，用WesternBlot去检测差异表达膜蛋白和核蛋白，验证前期亚细胞蛋白质组学筛选鉴定结果的可靠性。结果：（1）TCE染毒L-02细胞2

6、4h后的半数抑制浓度为16.0mmol/L。采用1/2的IC50为最大染毒剂量，发现2.0mmol/L，4.0mmol/L，8.0mmol/LTCE染毒组与对照组（0mmol/L）相比均具有显著性差异，TCE对细胞的增殖活性产生影响显著。Na+/K+-ATPase在膜蛋白组分中的表达水平显著高于在全蛋白组分和胞浆蛋白组分（全蛋白质、胞浆蛋白和膜蛋白质的相对浓度分别为1.0±0.10、0.12±0.01和1.5±0.16,P<0.01）。LaminB1在核蛋白组分的表达水平显著高于全蛋白和胞浆蛋白组分（全蛋白质、胞浆蛋白和核蛋白质的相对浓度分别为1.0±0.05、0

7、.08±0.01和2.3±0.28,P<0.01）。这些结果表明膜蛋白质和核蛋白质均在各自组分得到良好的富集，可用于后续分析。（2）利用2D-DIGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法共鉴定出15个差异蛋白。通过TMpred数据库分析，发现在膜蛋白组分的15个差异蛋白中，有10个具有1个以上的跨膜结构域，说明这10个蛋白为膜蛋白。另外4个蛋白没有跨膜区，但它们的亚细胞定位与细胞膜相关。而在核蛋白组分的24个差异蛋白中，有22蛋白的亚细胞定位与细胞核相关。DAVID富集分析表明差异表达蛋白主要与RNA过程相关，尤其在RNA剪接这一生物学过程出现明显的聚集。通

8、过STRI