采用蛋白质组学的方法研究葡萄糖对人腹膜间皮细胞的影响

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1、博士学位论文中文摘要摘要研究背景：持续不卧床腹膜透析(Continuousambulatorvperitonealdialysis，CAPD)是终末期尿毒症患者肾替代治疗的主要方法之一，随着透析装置、透析技术的不断改进，腹膜透析病人逐年增长，约占所有透析病人的15％。CAPD病人5年的生活质量、生存率、就业率与血液透析患者比较无明显差异。影响腹膜透析发展主要原因是随着透析时间的延长病人透析效能降低。大量研究表明腹膜纤维化是透析效能降低的重要原因。有关腹膜纤维化的机理目前仍不十分清楚，多数学者认为：腹膜透析时腹膜长期接触高渗、高糖和酸

2、性等非生物不相容性腹透液可导致慢性炎症反应和腹膜的损伤，导致第一道生理屏障——腹膜间皮细胞(humanperitonealmesothelialcells，HPMCs)发生显著的形态学改变：如细胞表面微绒毛由长变短最后消失、细胞增大甚至细胞剥脱、微丝骨架解体、新血管形成，腹膜细胞外基质增多，最后导致腹膜腹膜纤维化，超滤丧失。虽然有很多研究解释这些现象的发生，但是具体高糖对腹膜间皮细胞的病理生理作用仍不十分清楚。蛋白质组(pmteomes)是1994年澳大利亚科学家Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出。它

3、能系统地分析蛋白质的特性、数量及功能。它以二维凝胶电泳(2-DE)技术为基础，结合质谱技术、数据库与检索系统完成蛋白质分析。已被广泛运用到其他学科，特别是肿瘤病因探讨、寻找新的生物标志物、开发新药等。我们拟用上述蛋白质组的原理大批量分析蛋白质，研究腹透液中高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞的影响是否与蛋白质变化有关，并探讨蛋白质改变与腹膜纤维化是否存在内在联系和腹膜纤维化发生发展规律，以寻找干预或预防腹膜透析液中高糖导致CAPD患者腹膜纤维化的有效方法或治疗措施。但迄今为止使用蛋白质组方法分析高糖对腹膜间皮细胞的影响的研究还未见报道。本博士

4、学位论文分为三部分，第一部分使用常规方法分析腹透液中高糖对人腹膜间皮细胞影响，即对HPMCs增殖、损伤、细胞因子和细胞外基质的影响；第二部分使用2-DE构建对照组和高糖组HPMCs的蛋白质图谱，比较蛋白质变化并寻找差异蛋白质；第三部分利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix．assistantedlaserdesorption／ionizationtime—of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF．MS)博士学位论文中文摘要技术、查询数据库，鉴定差异蛋白质。本研究主要目的、方法、结果和结论概述

5、如下：目的：研究腹透液中葡萄糖对HPMCs分泌蛋白质影响，并采用蛋白质组学方法分析其对腹膜纤维化和腹膜功能的影响。方法：采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离HPMCs，建立稳定的体外腹膜间皮细胞培养，第三代用于实验。实验分组：24h、48h两个时间点，每一个时间点又分为对照组(F12培养基)和高糖组(F12培养基+4％葡萄糖)。检测方法：1．四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法邮法)测定细胞增殖；2．全自动生化分析测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平；3．使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养上清液中结缔组织生长因子(a附F)、转化

6、生长因子BI(TGFB11及纤维连接蛋白(FN)蛋白质水平；4．用RT—PCR测定TGFB1、FN及纤溶酶原激活物抑制剂．1(I'AI．1)mRNA表达；5．经2．DE分离人腹膜间皮细胞总蛋白，银染显色，每组重复三次，PDQttgst图象分析求差异蛋白质；6．MALDI．TOF．MS鉴定部分差异蛋白质。结果：1．高糖抑制HPMCs增殖，24h、48h高糖组MTF与对照组比较明显降低Q《o．01)i2．高糖明显损伤HPMCs，24h、48h高糖组LDH与对照组比较明显上升(p<0．01)；3．CTGF、TGFB1及FN蛋白质水平表达有

7、差异，24h、48h高糖组与对照组比较明显上升(p<0．05)：4．TGFB1、FN及PAI．1mRNA表达也有不同，24h、48h高糖组与对照组比较明显上调；5．经2-DE分离蛋白质，共获分离胶12块，每组3块，通过PDQuest图象分析软件对每组三块胶图谱分析后显示：24h对照组平均斑点数为：738±81，平均匹配点数为：619±98，匹配率为84．2％。24h葡萄糖组平均斑点数为：757±173，平均匹配点数为：651+126，匹配率为86％。48h对照组平均斑点数为：691+117，平均匹配点数为：571_+91，匹配率为8

8、2．6％。48h葡萄糖组平均斑点数为：658+69，平均斑点数为：557_+74，匹配率为84．7％。24h三块胶的位置重复性显示：水平偏差1．124-0．30mm，垂直偏差2．24±o．74mm。48h三块胶的位置重复性显示：水平偏