蛋白酶体抑制剂dci对胃癌细胞增殖的影响

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1、蛋白酶体抑制剂DCI对胃癌细胞增殖的影响【摘要】目的:探讨蛋白酶体抑制剂3，4二氯异香豆素(DCI)对人胃癌细胞系BGC823体外增殖和凋亡的影响。方法:将DCI加入BGC823胃癌细胞,采用MTT法检测细胞的生长抑制效应,AnnexinⅤ/PI法及电镜观察DCI对细胞凋亡的诱导作用。结果:DCI可明显抑制BGC823细胞体外增殖,随着DIC浓度的增加和处理时间的延长,细胞凋亡率增加;流式细胞术显示DCI可诱导胃癌细胞早期凋亡，细胞被阻滞在G1期；电镜观察发现,经DCI处理后的部分细胞具有凋亡细胞的典型形态特征。结论:DCI可抑制人胃癌BGC823细胞增殖并促进其凋亡。【

2、关键词】蛋白酶体抑制剂;胃癌;细胞凋亡；细胞增殖　泛素蛋白酶体系统（ubiquitinproteasomepatharin,DCI)同样具有抑制蛋白酶体的功能，对肿瘤细胞也有抑制作用，本研究观察其对胃癌细胞生长增殖的影响。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1细胞与培养人胃癌细胞BGC823购自上海细胞中心，置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,在37℃、5%CO2培养箱中培养，使用时以0.25%胰蛋白酶消化。　　1.1.2试剂DCI购自SantaCruz公司，溶于二甲基亚砜(DMSO)中,配成浓度为50mmol·L-1的贮存液,4℃保存,用时稀释；四甲基偶

3、氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品；RPMI1640培养基购自Gibco公司；流式细胞仪为美国BD公司FACScalibur型号；酶标仪为BIORED550型。　　1.2方法　　1.2.1MTT法测细胞生长抑制效应取对数生长期细胞接种于96孔板,每孔5×103个细胞,孵育过夜后,实验组分别予终浓度为25、50、100、200、400、600、800μmol·L-1DCI,对照组予不含DCI的培养液,每组设3个复孔,各组分别培养6、12、24、48h,用MTT法测每孔吸光度（A）值。　　1.2.2AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布实验组分别用终

4、浓度为150、300μmol·L-1的DCI处理BGC823细胞,对照组予不含DCI的培养液,均继续培养24h后收集细胞,用PBS洗2次,采用AnnexinⅤ和PI荧光染色、流式细胞术定量分析细胞凋亡状况及周期分布。　　1.2.3细胞超微结构观察收集经300μmol·L-1的DCI处理24h后的BGC823细胞及未经DCI处理的对照组细胞,戊二醛和锇酸双重固定,乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色,透射电镜观察。　　1.3统计学处理数据用x-±s表示，应用SPSS10.0软件Probit(概率单位法)计算，并行线性回归分析。　　2结果　　2.

5、1DCI对胃癌细胞增殖的影响MTT法检测结果显示，100～800μmol·L-1的DCI对胃癌细胞均有抑制作用，见表1,12、24h的IC50分别为478和398μmol·L–1。24h回归方程为Y=-000104X±0.91476,其中Y、X分别为细胞率和DCI的浓度。Y和X的相关系数r为0.98,P<0.01。　　表1MTT法检测DCI对胃癌细胞增殖的影响（略）　　2.2DCI对BGC823细胞周期分布和凋亡率的影响DCI作用于BGC823细胞24h后收集细胞,用流式细胞术检测细胞周期,各个周期细胞百分比改变见图1。150和300μmol·L–1浓度的DCI处理

6、BGC823细胞,G0/G1期细胞增加,而G2和S/M期细胞明显减少（表2）。图2表示DCI作用24h后细胞的凋亡率。经流式细胞术检测，正常培养的BGC823细胞凋亡率为2.54%，而经150μmol·L–1DCI作用后,凋亡率已达18.27%,G1期前出现凋亡峰，DCI浓度为300μmol·L-1时,细胞凋亡率达23.86%,显示DCI诱导的BGC823细胞凋亡具有量效关系。　　2.3透射电镜观察结果对照组细胞体积大,细胞器丰富,染色质均匀(图3A)。经DCI作用后部分BGC823细胞出现细胞凋亡的形态学特征:细胞体积缩小,胞浆浓缩,细胞器减少,出现空泡，染色质固缩、边缘

7、化,并形成凋亡小体(图3B)。　　3讨论　　蛋白酶体抑制剂可有效地诱导恶性、增殖程度高的细胞凋亡,对正常细胞几乎无作用,从而成为治疗肿瘤的新途径[6]。DCI最初是作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，随后有多项研究显示DCI对UPP有明显抑制作用。早老素可以诱导AlzhEimer病发生，其降解主要依靠蛋白酶体系统降解，蛋白酶体抑制MG132可以抑制早老素的降解，DCI也可以抑制其降解，但效率较MG132低，而同样作为广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂的AEBSF对早老素降解无作用[7]。DCI还可抑制泛素化的生长相关蛋白GAP4