柽柳rd22基因的载体构建及功能验证

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1、／h。誊0摘要本研究是将从多枝柽柳(砌超甜西删傩船泐)中克隆出来的盐、旱胁迫应答基因——讹2基因(respollSivetodehydr撕on22)构建到植物表达载体pROKII上，通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化，来验证肋2基因的功能。共获得105个卡那霉素抗性芽，对其中33株长势优良的转基因株系进行PCR检测，有26个株系结果呈阳性；进而又对其中的6株进行PCRISouⅡ1em印迹杂交检测，结果全部为阳性；通过I汀．PCR和实时荧光定量PCR检测分析，各个转基因株系外源基因的表达水平相对于内标基因GAPDH(甘油醛．3．磷酸．脱氢酶)的

2、表达水平在17．12～154．23之间，证实转入的外源基因在RNA水平上能够表达。对转胧2基因烟草当代(To)6个转基因株系进行了盐、碱胁迫试验，测定并分析了胁迫前后各转基因烟草及非转基因对照烟草的相对电导率、丙二醛(加A)含量、SOD活性和POD活性的变化，以及相对生长量、生根率和盐、碱害情况的差异，并对盐胁迫下各株系叶片的分化率进行了统计，结果如下：在不同浓度的盐、碱胁迫下，各转基因烟草的细胞膜受损情况明显低于非转基因对照烟草，而SOD活性、POD活性均高于非转基因对照烟草。在220n沛01．L．1的NaCl胁迫下，非转基因烟草生长受到

3、抑制，不能生根，盐害指数高达76．7％，而各转基因烟草平均生根率为28．9％，其中生根率最高的nB株系为40％。各转基因烟草的鲜重增加均高于非转基因对照，平均鲜重比对照高出17．73％。将烟草叶片分别接种在含220mmol·L-1NaCl的分化培养基中，叶片再生结果显示，非转基因烟草在该盐浓度条件下叶片受到严重伤害，不能分化，而各转基因烟草叶片分化率在20％～40％之间。对转基因烟草进行了NaHC03胁迫处理，结果表明：在30nuIlol·L．1N枷C03胁迫下，非转基因烟草生根受到抑制，不能生根，而各转基因烟草大部分生长较好，均能够生根，

4、平均生根率达到28．9％，其中nB株系生根率最高，为40％，各转基因株系平均生长量高于对照的54．96％。实验表明，由于外源基因耽2在转基因烟草中的组成型表达，提高了烟草的抗逆能力，大大地减少了盐、碱对转基因烟草的伤害。充分证实了来源于柽柳的以挖基因具有提高烟草耐受Nacl和NaHC03的能力。关键词烟草：以挖基因；NaCl胁迫；NaHC03胁迫；功能验证，．^，心．奄、、L、、、F。’．，‘泰，一’-AbstraclAbstractThe砘2genewaSo比血ed舶m砀聊甜￡z鼢w}1ichisadrou曲t沱sistarlCea11d

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7、ressionleVelof耽2genewere17．12～154．23血1esⅡlan慨ofGAPDHgenei11me6liIles．IllNaCla11dNaHC03s吮sstest，wedetc舢ined锄da11alyzedt11erel撕veconductiV时、砌ondialdehyde(ⅧA)comentS、也eactiV时ofsuperoxidedismu眺e(SOD)andperoxidaSe(POD)betv岭enme6咖geIlictobaccoandcontroltobacco，comp钟edmerelatiVeg

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