多功能脂质体基因载体的构建及评价

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1、浙江工业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。作者签名：钯锄日期：驯件‘月毕日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本

2、人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在——年解密后适用本授权书。2、不保密口。(请在以上相应方框内打“4”)作者签名：导师签名：钯枷浙江工业大学硕士学位论文多功能脂质体基因载体的构建及评价摘要多功台g匕H_,／J匕iEl质体作为基因载体，在基因治疗中的应用越来越受到重视，展现出了广阔的应用前景。本文以叶酸一聚乙二醇一胆固醇半琥珀酸酯(F-PEG—CHEMS)和硬脂酰八聚精氨酸(R8)作为功能成分，构建多功能脂质体，并把它作为A

3、SODN和质粒DNA的载体，考察其理化性质和细胞的摄取行为与转染效果，探索其作为基因药物细胞内给药系统的可行性。首先，本文在调研有关文献基础上，设计出了胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)、聚乙二醇单甲醚一胆固醇半琥珀酸酯(MPEG-CHEMS)和F-PEG-CHEMS的合成路线。CHEMS是以胆固醇和丁二酸酐为原料通过酯化反应制备；MPEG-CHEMS是以聚乙二醇单甲醚(MPEG)和CHEMS为原料通过酯化反应制备；F-PEG—CHEMS的合成分三步完成：首先叶酸与聚乙二醇二胺(NH2一PEG_N也)反应制备F-PEG：㈣-NH：，然后胆固醇半琥珀

4、酸酯(CHEMS)与N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应制备NHS—CHEMS，最后F-PEG-NH2与NHS—CHEMS反应，得到F-PEG-CHEMS。合成并纯化的产物经TLC，工R，质谱和1H—HMR谱分析，确证为目标产物。合成并纯化了的脂质体膜材MPEG—CHEMS与F-PEG—CHEMS，为多功能脂质体的制各奠定了基础。其次，用薄膜分散法制备普通脂质体，并把R8水溶液与普通脂浙江工业大学硕士学位论文质体在45℃孵育1h，制备R8修饰的脂质体(R8一Lip)，同时对其进行理化性质和细胞水平的评价。实验结果表明，普通脂质体经R8修饰后，粒径和

5、分布基本不变，而zeta电位由-i0．24mV变为+38．69mv。当R8一Lip／ASODN复合物中+／一超过4：1时，ASODN已与R8一Lip完全结合成带正电的复合物；当R8一Lip中R8的浓度小于10ug／mL时，细胞存活率大于75％；RS-Lip对ASODN细胞摄取的促进作用与R8的浓度有关，当R8的质量浓度由0．3ug／mL增加到9．612g／mL(+／-由1：2增加到16：1)，细胞内荧光强度逐渐增加；当R8一Lip／ASODN复合物中+／一=16：1时，R8对ASODN摄取的促进作用强于市售的转染试剂Lipofectamine2

6、000。在R8-Lip表面PEG化修饰后，促进细胞摄取ASODN的效果很差。为了进一步提高细胞摄取效果，在PEG末端接上叶酸配体，构建了多功能脂质体R8一Lip—F，并对其进行理化性质和细胞水平的评价。实验结果表明，该脂质体的形态规整，几乎全部呈球形。R8一Lip—F／ASODN在+／一为16：1时复合物完全被阻滞在上样口。R8一Lip—F／ASODN复合物在6h内的细胞摄取量和阳性率随时间的增加而增加。R8一Lip—F／ASODN复合物通过内吞途径入胞，且具有能量依赖性。其入胞机制主要是网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用，并且细胞摄取量会因叶酸的

7、竞争性抑制而降低。ASODN入胞后大部分分布在胞浆中，细胞核中几乎没有。与市售的转染试剂Lipofectamine2000相比，R8-Lip-F对ASODN摄取的促进作用要强一些，但其对质粒DNA的转染几乎无促进作用，转染效果远差于市售的转染试剂II浙江工业大学硕士学位论文L1pof。ectamlne2000。最后，以DOTAP脂质体为基础，并在其中引入F-PEG-CHEMS与R8，构建多功能阳离子脂质体R8一DOTAP—F，同时对其进行理化性质和细胞水平的评价。实验结果表明，R8-DOTAP—F的形态规整，几乎全部呈球形。在R8一DOTAP—

8、F复合物中DOTAP与pDNA或ASODN质量比为30(正负电荷比或N／P约为13：1)时，pDNA和ASODN被结合完全。R8一DOTAP—F／AS