rsistin基因的克隆及载体的构建.doc

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1、rsistin基因的克隆及载体的构建【摘要】目的：克隆小鼠resistin基因及其连载体的构建，为进一步研究resistin的功能打下基础。方法：根据报道的小鼠resistin基因的全长mRNA序列为目的基因，即提取小鼠脂肪组织中的RNA，以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，逆转录（RT）合成resistinDNA，再在TaqDNA聚合酶的作用下聚合酶链反应（PCR）扩增resistincDNA，将扩增PCR产物（resistincDNA）经纯化后与AT连接于pGEMT载体，重组质粒转化JM

2、109感受态菌，蓝白斑筛选阳性菌落，摇菌、提取质粒。结果：提取的总RNA纯度A260/280为1.9,电泳条带28s∶18s比例约为2∶1,RTPCR与欲扩增的目的片段的理论长度363bp相符,重组质粒插入pGEMT的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。结论：成功克隆了小鼠resistincDNA基因，为构建resistin基因打下基础。【关键词】小鼠resistin基因；载体；构建　　resisin又称抵抗素，可损害糖代谢，影响组织对胰岛素的敏感性［

3、1］，被认为可能是联系肥胖与Ⅱ型糖尿病的重要纽带［2,3］。小鼠resistin基因mRNA全长519个碱基,编码区(cds)是由84位至428位共345个碱基组成,编码114个氨基酸残基组成的resistin蛋白质。目前对resistin的生物功能了解甚少，为了探讨resistin的功能，本研究拟用RTPGR技术从小鼠脂肪组织中扩增resistincDNA，A/T克隆于pGEMT载体。为进一步研究resistin功能及与糖尿病的关系奠定实验基础。　　1材料与方法　　1.1主要试剂TRIol

4、Reagent总RNA提取和THERMOSCRIPTTMRTPCRSystem（购自GIBCOLBRL公司），PCG引物（由TakaRaBiotech公司合成）QiaquickGelExtractionKit、PlasmidQiaprepSpinMiinprepKit和EndofreePlasmidMaxiKit（购自QIAGEN公司），pGEMTvectorsystemI（购自promega公司），限制性内切酶XbaI、EcoRI和NotI(购自ENB或MBIFermenta或Rroche

5、公司),T4DNA连接酶(购自TakaraBiotech公司)，JM109大肠杆菌由本院医学研究中心提供。　　1.2方法　　1.2.1总RNA测定提取总RNA：取正常雄性BALB/C小鼠，16周龄，体重38g（购自中山大学动物实验中心）。取其脂肪200mg，按照一步法提取总RNA。检测总RNA：电泳检测总RNA质量；紫外分光光度法检测总RNA纯度和含量。RNA浓度计算：RNA=A260×40×稀释倍数。　　1.2.2逆转录合成cDNA按MmnlvRTPCR试剂盒说明书操作逆转录合成cDNA。3

6、　　1.2.3PCR扩增resistincDNAPCR引物设计,根据小鼠resistin基因mRNA序列,用计算机软件设计引物,并在上、下游引物的5’端分别引入EcoR1和XbaⅠ酶切位点。上游引物：5'CGGAATTCATGAACCTTTCATTTCC3'（下划线的部分为EcoR1酶切位点）；下游引物：5'CTAGTCTAGATCAGGAAGCGACCTGCAGCT3'（下划线的部分为XbaⅠ酶切位点）；扩增resistin基因全长编码区序列,扩增片段理论长度为363bp。在一个50μ

7、l的反应体系中进行PCR，并对反应体系中RT产物、引物和MgCl2的量及热循环参数进行了数次优化，共同进行了35循环。2%的琼脂糖凝胶电泳成像。　　1.2.4凝胶回收纯化PCR产物按QiaquickGelExtractionKit操作说明，凝胶电泳观察回收结果,紫外分光光度法检测DNA含量及纯度检测。　　1.2.5受体感受态JM109菌的制备用CaCl2法(0.1M的进口CaCl2)制备感受态细胞。　　1.2.6纯化PCR产物AT连接于pGEMT载体按插入片段与载体的摩尔比为3∶1的量进行连

8、接反应,总反应体系10μl,置4℃冰箱过夜连接。　　1.2.7连接反应液转化JM109感受态菌液连接DNA反应液10μl,加入200μl受体感受态菌液中，最后行蓝白斑筛选，挑选单个白色菌落，加入2μlLB液体培养基中（含氨苄青霉素），37℃震荡增殖转化菌。　　1.2.8提取重组质粒PGEMTreisitin上述菌液扩增至生长晚期，按QiaprepSpinMiniprepKit操作说明提取质粒。凝胶电泳提取的重组质粒的质量和紫外分光光度法检测DNA含量及纯度检测。　　1.2.9鉴定和保存重组质