猪ppart基因肌肉超表面真核表达载体构建以及在转基因小鼠中的功能验证

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1、华中农业大学博士学位论文猪PPART基因肌肉超表面真核表达载体构建以及在转基因小鼠中的功能验证姓名：黄锦亮申请学位级别：博士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：熊远著201206猪P剧R佗基因肌肉超表达真核表达载体制备以及在转基因小鼠中的功能验证摘要肌内脂肪(Intrarnuscularfat，IMF)是肉质细嫩多汁和口感好的物质基础，IMF含量的增加可以使肌肉嫩度、多汁性和肉色得到提高。目前在对猪肉质的评定指标中，肌内脂肪的含量已经成为肉质指标中最关键的参数。但自二十世纪七十年代以来，国内外在瘦肉型猪的选育中一直侧重于对瘦肉率的选择提高，高瘦肉率的选择导致瘦肉型猪IMF含量

2、降到了1．5％左右，低于了最适范围，极大地降低了猪肉品质。如何能在保证瘦肉率的前提下提高IMF含量，己成为育种者研究的目标。PPARy2在脂肪细胞分化，成熟中起着关键作用，研究表明，PPARy2决定哺乳动物的体脂分布，与肌肉中的脂肪含量有关。因此，本研究以PPAR)，2作为候选基因，构建了肌肉特异性真核表达载体，从细胞水平和转基因模型小鼠进：行研究细胞或肌肉超表达PPAR?2的影响，期望发现肌肉超表达PPAR72和LMF以及其他指标的关联，为培育高品质瘦肉猪建立转基因模型。取得的主要研究成果有：1．以真核表达载体pEGFP-N1为框架，从猪MCK基因的BAC中采用基因抓捕技

3、术，钓取了7Kb的MCK启动子序列，构建载体pEGFP-N1L．MCK，Sa／I和Nofl进行双酶切，得到大片段pEGFP．NIL．MCK。以人工合成的PPAR72cDNA全长质粒(pMD一18．PPAR?2)为材料，分别用SalI和NotI进行双酶切，得到基因PPAR?2片段。将前面两部得到的大片段pEGFP-N1L．MCK和PPAR72cDNA进行连接，得到真核表达载体pEGFP-N1L．MCK-PPAR72。通过载体部分测序，PCR检测，以及BgllI的酶切鉴定无误，说明真核表达载体pEGFP．N1L．MCK-PPARy2构建成功。2．以猪35日龄胚胎为材料，培养出原

4、代成纤维细胞系，并将构建好的真核表达载体pEGFP-N1L—MCK-PPARy2瞬时转染成纤维细胞和C2C12细胞，RT-PCR检测表明，PPAR72能够在成纤维细胞和C2C12超表达，并且使脂肪合成相关基因SCD2、LPL、ACC等表达上调。同时，将线性化的载体转染小鼠的成肌细胞C2C12，经G418筛选，获得稳定转染的细胞株，PCR检测阳性，RT-PCR检测表明，阳性细胞PPARy2较阴性细胞表达大幅增加。通过以上两种细胞转染实验可见MCK启动子能够带动PPAR72在成纤维细胞和成肌细胞中超表达。3．通过显微注射法得到阳性Founder小鼠5只，分别将阳性公母小鼠与阴性

5、异性小鼠交配，生下Fl代，对2周龄小鼠采用PCR技术检测出阳性小鼠。通过RT-PCR和WesternBlot检测发现PPAR72在阳性小鼠骨骼肌和心肌高表达，肝脏，肾脏中等，脂肪，小肠，睾丸等表达量很少，这一结果与MCK在哺乳动物不同组织的表达相华中农业大学2012届博士学位论文符，表明我们构建的真核表达载体能够在转基因小鼠中正常表达，也表明猪MCK启动子和小鼠MCK启动子一样，能够驱动基因在肌肉组织中超表达。4．我们对骨骼肌中脂肪合成，转运等相关基因通过RealTimePCR对mRNA检测发现脂肪相关基因表达得到不同程度的增加，如脂肪酸结合蛋白(FABP4)mRNA增加1

6、3倍，脂蛋白酯酶(LPL)增加1倍，DGATl增加51％，脂肪酸合成酶(FAS)增加1．1倍，而能够降解脂肪的激素敏感脂肪酶(HSL)降低了62％。同时也发现SCD2表达减少。通过连续测定小鼠4．16周体重显示，转基因阳性小鼠体重与阴性小鼠差异不显著。通过对肌肉中甘油三酯的测定，阳性小鼠骨骼肌甘油三酯增加30％(p<0．01)，游离脂肪酸增加16％(p<0．01)，而血液中甘油三酯和血糖均差异不显著。我们对肌肉组织中脂肪酸组成进行了气相色谱测定，发现多不饱和脂肪酸C18：2、C20：4、C22：6增加，达到差异极显著水平。C16：1增加(P

7、0．01)。实验还对骨骼肌糖代谢相关基因进行检测，发现，葡萄糖转运蛋白l(Glutl)，葡萄糖转运蛋白4(Glut4)，磷酸葡萄糖异构酶(glucosephosphateisomerase1)，果糖二磷酸酶(fructosebisphosphatase2)，丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvatedehydrogenasekinaseisoenzymel)等表达量增加，磷酸变位酶(phosphoglyceratemutase1)表达减少，糖元合成酶(glycogensynthase2)差异不显著。5．在试验中，对皮下脂