广西巴马小型猪tau基因真核表达载体的构建及功能验证

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1、分类号UDCS813．3硕士学位论文广西巴马小型猪Tall基因真核表达载体的构建及功能验证陈少梅学科专业动物遣佳直弛墨繁殖指导教师整独生砑窒员论文答辩日期2Q13生鱼月3目学位授予日期答辩委员会主席兰王堡数握广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡

2、献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。留不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：陆穸桶指导教师签名：萼m．作者联系电话：J肌踟蛆2，日期：沙f≥．6

3、．-]日期山仔．叩电子邮箱：奠加钾p痧矿Z圳广西巴马小型猪Tat,,基因真核表达载体的构建及功能验证摘要Tau蛋白可促进微管蛋白聚集形成微管并保持其稳定性，过度磷酸化时会在神经元内形成神经纤维缠结，是阿尔茨海默病的标志性病变之一。本研究的目的是通过克隆广西巴马小型猪Tau基因，构建其真核表达载体，并对其功能进行验证，为广西巴马小型猪阿尔茨海默病模型的制作奠定基础。根据GenBank中猪的Tau基因预测序列设计引物，以广西巴马小型猪脑组织总RNA进行RT-PCR，获得的序列与参考序列相比缺少1134bp。应

4、用巢式PCR和5'RACE进行缺失片段的验证，发现一处编码区缺失(+344,-,+1389bp)和两处选择性剪接(+191~+277bp、+1526,-d-1579bp)，由此构成了四个可变剪接体。将4个序列提交至GenBank中，获得四个登录号KC473498、KC473499、KC473500、KC473501。参考人的PDGF-B基因转录起始位点上游序列设计两对引物，用于扩增PDGF-B基因的启动子，获得PDGF—I)305和PDGF—p1501两段长度不同的序列，并克隆至保留启动子的pEGFP．N

5、1和不含启动子的pEGFP一1载体中。神经细胞PCI2的转染实验结果表明PDGF—p305和PDGF—p1501片段均具有启动子功能，PDGF—p305的启动能力强于PDGF．p1501，双启动子的载体的启动功能强于单启动子载体。将启动功能较强的载体pPDGF-13305一EGFP—l和pPDGF—IB305-EGFP-N1转染至神经细胞PCI2与非神经细胞PKl5和C2C12中，结果显示pPDGF一13305具有较高的神经组织特异性。利用Taul215片段构建真核表达载体pPDGF一13305．Taul

6、215-EGFP．1和pPDGF-13305一Taul215．EGFP-N1，转染PCI2细胞发现，前者的表达量低于后者，且后一组的细胞形态发生明显改变；利用脂质体介导法将质粒pPDGF一13305一Taul215一EGFP-N1直接注射小鼠睾丸及卵巢生产转基因小鼠，经PCR验证，在F1代小鼠中阳性小鼠的比率为13．9％。以上结果表明：本研究成功克隆了广西巴马小型猪Tau基因，构建了真核表达载体pPDGF一13305一Taul215一EGFP．1和pPDGF-13305一Taul215．EGFP-N1，并

7、可在细胞中表达，为后期广西巴马小型猪阿尔茨海默病动物模型的制作奠定了基础。关键词：广西巴马小型猪阿尔茨海默病Tau基因PDGF—pTHEC0lNSTRUCTl0INANDFOI胭ATl0NAI，IDENTIFYCATIONOF2么UGE八哐EI7KARYOTICEXPRESSIONⅦCTOROF(H7ANGⅪBAMAM匝NI．PIGABSTRACTTauproteinhasanimportantroleintheformationandstabilityofcytoskeleton．Hyperphosph

8、orylationofTauproteinwillleadtoneurofibrillarytangles，whichisoneofmarkersforAlzheimer'sdisease．Thus，theobjectiveofcurrentstudyistocloneandconstructtheeukaryoticexpressionvectorofTaugenefromGuangxiBamamini—pigandtoid