广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建.pdf

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1、南方农业学报JOURNALOFSOUTHERNAGRICULTURE2013，44(9)：1558—1563ISSN2095—1191；CODENNNXAABhttp：／／www．nfnyxb．cnDOI：10．3969／j：issn．2095—1191．2013．9．1558广西巴马小型猪仪干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建吴丹L2，兰干球-，郭亚芬-，陈宝剑1，陈少梅1，蒋钦杨1+(1广西大学动物科学技术学院，南宁530005；2桂林医学院基础医学实验教学中心，广西桂林541002)摘要：【目的】克隆广西巴马小型猪ot干扰素基因(polFN-a)全部

2、编码序列并构建其ntH孚L动物真核表达载体，为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据。【方法】应用RT—PCR扩增广西巴马小型猪polFN-a编码序列，链接至pMDl8-T载体构建重组质粒，以测序正确的重组质粒为模板，PCR扩增带有酶切位点的polFN-a基因，然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET—polFN—ot，并转化感受态细胞DH5a，经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序，用DNASTAR软件及PrimerPremer5．0等对获得的基因序列进行分析。【结果】以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获

3、得的目的片段为618bp，包含polFN-a基因全部编码序列；将克隆获得的polFN-a基因插人哺乳动物真核表达载体pTARGET中，可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTAR-GET．polFN一0【。广西巴马dx型猪polFN-a与GenBankJ2已发表的猪、鼠、人删．d基因同源性分别为97．o％、78．2％和66．3％；其成熟肽与普通猪相比，共有17个位点发生碱基突变，其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变，第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变。【结论】IF

4、NLa成熟肽在哺乳动物中保守性较差；克隆获得的广西巴马小型猪polFN-a基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGETqb构建重组表达载体pTAR—GET．polFN—ot，为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础。关键词：广西巴马小型猪；删一d基因；克隆；真核表达载体；构建中图分类号：$828．89文献标志码：A文章编号：2095—1191(2013)09—1558—06Cloninginterferon-o【geneofGuangxiBamamini-pigandconstructingitseukaryoti

5、cexpressionvectorwuDanl”，LANGan—qiul，GUOYa—f色n1，CHENBao-jianl，CHENShao—meil，JIANGQin-yang1+(1CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China；2TeachingandExperimentCenterofBasicMedicineofGuilinMedicalUniversity，Guilin，Guangxi541002，China)Abstract：【Objectiv

6、e】AllcodedsequencesofBama—minipiginteferon—otgenewereclonedanditseukaryoticex—pressionvectorwasconstructedtoprovidereferencesforrestructuringswineinterferonimmunologicadiuvantandbiothera．PYpreparations．【Method]Apairofspecificprimersforporcineinterferon-alphal(polFN-a)wasdesignedan

7、dsynthesizedaccordingtogenesequence．andpolFN—olgenewasamplifiedbyRT—PCRfromperipheralsbloodlymphocytesofBama—minipig．ThenpolFN—aCDSwasclonedintopMDl8一Tvectorandsequenced．Moreover．po删一olgenewithenzymesiteswasclonedintoeukaryoticexpressionvectorpTARGETtoconstructrecombinantexpressio

8、nplasnfidpTARGET—polFN—danditwast