ebna2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能

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1、EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能【关键词】EBNA2ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofEBNA2andfunctionaldetectionofitsproduct【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofEBNA2andtoexpressitineukaryoticcellsanddetectthefunctionofitsproduct.METHODS:EBNA2genethep

2、lasmidpSG5EBNA2.PCRproductofEBNA2bidpMD18Tandsequenced.ThefulllengthEBNA2geneidpCMVHA.UsingLipofectamineTM2000,theplasmidpCMVEBNA2munofluorescence.TheactivityofEBNA2idpCMVEBNA2munofluorescence.ThetranscriptionalactivityofEBNA2onstratedbyreporterassay.CONCLUSION

3、:TheeukaryoticexpressionvectorpCMVEBNA2hasbeensuccessfullyconstructedandsuccessfullyexpressedineukaryoticcellline.TheEBNA2proteinhastranscriptionalactivation.【Keyyc等，同时还可以抑制细胞免疫球蛋白重链的转录.Notch信号途径是体内一个非常保守的信号途径，在体内分布十分广泛〔2〕.EBNA2可以与Notch信号途径中的重要分子RBPJκ相结合，激活下游靶基

4、因，并通过模仿Notch信号途径对体内淋巴细胞的分化和发育方向起调控作用〔3〕.同时EBNA2还可以促进抑癌分子p53的磷酸化〔4〕，调节癌基因的表达.我们对EBNA2基因进行了克隆，并在真核细胞中表达，为进一步探讨其对小鼠免疫系统发育过程的影响奠定基础.1材料和方法1.1材料大肠杆菌XL10；质粒载体pCMVHA，pBluscript（-），pGA9816为本室保存.载体pMD18T购自TaKaRa公司.Cos7细胞为本室保存.脂质体LipofectamineTM2000及细胞培养试剂均购自Invitrogene公

5、司.抗EBNA2抗体购自Dako公司，HRP标记抗小鼠IgG,FITC标记抗小鼠IgG购自博士德公司.小量质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自华瞬生物工程公司.PCR试剂盒、各种限制性内切酶购自TaKaRa公司.根据GenBank中EBNA2基因的序列，设计2条引物：引物2的5＇端加入XhoⅠ位点，引物1和引物2用于扩增EBNA2基因的3＇端部分（EBNA2b）.引物1：5＇CTCGGGGCCACCATGGTGGC3＇；引物2:5＇CGCCTCGAGTTACTGGATGGAGGGG3＇.1.2方法1.2.1EBN

6、A2基因的克隆及真核表达载体的构建EcoRⅠ/BglⅡ/SalⅠ三酶切质粒pSG5EBNA2，胶回收4.0kb大小片段，将回收片段插入经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切开的pBluscript（-）载体中，命名为pBSSKEBNA2.以pSG5EBNA2为模板，用引物1和引物2进行常规PCR反应，扩增EBNA2基因的3＇部分EBNA2b.PCR反应条件：于94℃变性5min后，按下列参数循环35次：即94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后于72℃延伸7min.PCR产物克隆到pMD18T载体中，Nco

7、Ⅰ/XhoⅠ酶切鉴定阳性克隆，命名为pMDEBNA2b.用NcoⅠ/XhoⅠ从pMDEBNA2b中切下EBNA2b片段插入用NcoⅠ/XhoⅠ切开的pBSSKEBNA2载体pBSSKEBNA2a中，NcoⅠ单酶切和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，命名为pBSSKEBNA2（a+b）.pCMVEBNA2用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切质粒pBSSKEBNA2（a+b），回收1500bp片段，将其插入EcoRⅠ/XhoⅠ切开的pCMVHA载体中，酶切鉴定阳性克隆，命名为pCMVEBNA2.1.2.2EBNA2表达的检测①20

8、0010μL转染质粒pCMVEBNA24μg.转染60h后裂解细胞收集蛋白上清，加入2×加样缓冲液，煮沸5min.然后进行120g/LSDSPAGE电泳，于180mA稳压状态下转膜3h.于室温用20g/L蛋白干粉封闭1h后，一抗antiEBNA2（1∶1000）4℃过夜.PBST洗涤3次，每次5min.二抗抗鼠IgGHRP（1∶4000）室温作