西伯利亚蓼（Polygonum+sibiricum）rd22基因的克隆、表达与功能验证

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1、摘要本研究利用RACE技术，从盐生植物一一西伯利亚蓼中克隆了趔22基因(GenBankaccessionnO．DQ836050)的cDNA序列，对该基因的生物信息学显示，rd22cDNA基因cDNA全长1302bp，其中开放读码框(ORF)为1218bp，编码405个氨基酸组成的蛋白。该蛋白是一个碱性的分泌蛋白，预测分子量为43．0kD，理论等电点为．9．47。RD22蛋白序列N端前21个氨基酸具有较强的疏水性，被预测为信号肽结构，对rd22基因编码的氨基酸序列进行同源分析，发现序列的C端存在一个保守的结构域。rd22基因编码的蛋白属于BURP蛋白家族，其具有共同的结构特征：(1

2、)N端疏水区；(2)短保守片段；(3)包含重复序列区域；(4)保守的BURP结构域。利用Northern杂交技术，对所克隆的rd22基因在盐胁迫下西伯利亚蓼各组织中的表达特性进行了研究。结果显示，西伯利亚蓼rd22基因在不同组织中表达模式具有时空多样性，在地下茎中不表达，在茎中大量表达但不受盐诱导，在叶中却受盐诱导。rd22基因编码的氨基酸序列中含有一个保守的BURP结构域，但其功能也是未知的。为验证rd22基因和编码BURP结构域的序列是否具有耐盐功能，将二者测序验证后连入植物表达载体pROKI]，构建了两个重组质粒pROK-rd22、pROK-burp。通过农杆菌介导法转化烟

3、草，经卡那抗性筛选，共获得了阱株抗性植株。选择部分转化株系进行PCR检测和Noilhern杂交分析，证明了外源基因己整合到烟草基因组中。除了一个株系外，都得到了转录水平的表达．分别选择4个转rd22烟草株系和4个转burp烟草株系进行耐盐碱试验，结果表明，200ret001．I，NaCI胁迫下转基因株系的根生长状况要好于非转基因株系；5retool·L-1NaHC03胁迫下，野生型烟草与转基因烟草生长状况差异不显著。因此，转基因烟草对中性盐的耐受力较好，强于碱性盐。对各株系进行了MDA含量及SOD、POD活性测定，200retool·L．1NaCI胁迫下转基因株系的MDA含量低于

4、非转基因株系，POD活性高于非转基因株系，但SOD活性无显著差异；5nmaol·pNaI-IC03胁迫下，各转化株系的三个生理指标与对照株系比未见显著差异。说明两个外源基因的转化使烟草的耐盐能力稍有提高，但增幅不显著；对耐碱能力没有太大增加。因此，西伯利亚蓼的rd22基因及编码其BURP结构域的序列对烟草的转化没能提高转基西烟草组培苗对盐碱的抗性。西伯利亚蓼的rd22基因及编码其BURP结构域的序列有可能不属于耐盐功能性基因和耐盐结构域，不直接参与植物对盐碱胁迫的响应。关键词西伯利亚蓼；脱水应答基因rd22：盐胁迫；基因克隆；基因表达；烟草东北林业大学硕士学位论文Abstract

5、Inthisstudy,adehydration-respomiveproteingenerd22(GenBaakaccessioniio．DQ8360501isclonedfromahaiophytecalledPolygonurasibiricumbyusingRACEmethod．Sequenceanalysisshowsthatthe耐22geneis1302bpinlength,including1218bpofopenxeadingf3"alne(ORr'D．andencodesaproteinof405aminoacids．TheRD22proteinisallal

6、kalinesecretoryproteinwithapredictedmolecularmsssof43．Old)andpl9．47．TheN-tern吐nusoftheRD22proteinhasasignalpeptidestxuctureatthefirst21aminoacidsre#on,whichindicatesthatRD22functionasasecretoryproteinmaybetransferredtoaceHularspecificplaceoIsecxetedout砸础．强omologyanalysisshowstheC-terminusofth

7、eRD22proteincontainsaconservedBURPdomain,andRD22isthememberofBURPdomainproteinfamily．mBU】王Pdomainproteinsconsistoffourmodules：(1)anN-terminalhydrophobicdomain；(2)ashortconservedsegment；(3)alloptionalsegmentconsistingofrepeatedunits；(4)theC-te