斑马鱼干扰素γ基因克隆表达及生物信息学分析

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1、北京协和医学院硕士研究生论文摘要：目的：克隆斑马鱼的新基因ifn91．J和ifn91．2，验证其编码产物是否为干扰素Y；构建两个基因的原核表达载体，实现其原核重组表达，为深入研究这两个基因的功能奠定基础。方法和内容：首先通过eonA药浴，人工诱导斑马鱼干扰素的表达。即刻提取组织总RNA，通过RT-PCR检测这两个基因的表达情况，并对PCR产物进行测序以验证结果的正确性。然后将这两个基因克隆入表达载体pET24a，构建高效表达载体pET24a-ifn91．1和pET24a—ifn91．2，并将这两个基因做原核融合表达。同时运用生物信息学方法分析这两个基因的结构及功能域，进一步

2、验证这两种斑马鱼干扰素7基因是否存在。结果：利用RT-PCR方法，成功地从经过conA药浴的斑马鱼组织中扩增出与预期大小一致的DNA片段，而未经药浴的斑马鱼体内没有扩增到相应的DNA片段。通过测序证实了PCR产物就是目的基因的片段。表明这两个基因都能够被conA诱导表达，符合干扰素的基本特性，证实这两个基因不是假基因，但有可能是干扰素类物质。将目的基因连入表达载体pET24a，成功地构建了重组表达载体pET24a．ifn91．1和pET24a．ifn91．2。将载体转化BL21并用IPTG诱导融合蛋白的表达，经SDS．PAGE检测，成功的得到了和目的蛋白大小一致的产物。生物

3、信息学分析表明，这两个基因产物的大小、等电点、部分保守序列等符合干扰素Y的特征。但和人的干扰素相比Ifn91．2比Ifn91．1具有更高的同源性，二级结构和三级结构的预测结果显示，Ifn91．1具有5-a螺旋结构，而Ifn91．2具有6-a螺旋结构。干扰素丫的一个重要特征是具有6-a螺旋结构，因此Ifn91．2明显符合干扰素丫的特点。系统进化分析表明，虽然ifn91．1和ifn91．2在基因组上紧密连锁，但在长期进化过程中二者已经发生了明显分化。其中，ifn91．2和其它鱼类干扰素丫有较近的亲缘关系，而ifn91．1则较早从鱼类干扰素Y中分化并形成了新的分支。结论：本实验结

4、果显示：Ifn91．1和Ifn91．2都具有干扰素丫的一些基本特征；其中Ifn91．2即为干扰素Y；Ifn91．1在长期的进化过程中基因序列发生了大量变化而导致其结构的改变，属于从干扰素丫中分化出的新的一类干扰素。关键字：斑马鱼；干扰素7；原核表达；生物信息学北京协和医学院硕士研究生论文ABSTRACTobjeetiv铭：Toclonetwozebrafishgenes矽堙J『一J『andifngl一2；toconfirmwhetherifngl-jandifngl-2encodezebrafishinterferongamma；toconstructtwoexpressi

5、onvectorscontainingifngl一1andifiagl-2；tolaythefoundationforfurtherfunctionalstudiesofzebrafishinterferongamma．Methods：ExpressionofinterferongammagenewasinducedbymedicalbathofzebrafishwitheonA．TotalRNAWasimmediatelyextractedandtheinterferongammagenewasamplifiedbyRT-PCR．AmplifiedDNAfi'agment

6、sweresequencedtoidentifyifthesePCRproductsarefromtargetgenes．TargetgenesweresubcloncdintoavectorofpET24atoconstructrecombinantVectorspET24a-ifiagl·1andpET24a-ifngl一2．TheexpressionofafusionproteinWasinducedwithIPTGaftertransformingthevectorsintoBL21(DE3)．Finally,weconfirmedtheexpressionofth

7、efusionproteinwitllSDS．PAGEelectrophoresisandanalyzedtheirstructuresandfunctionaldomainsbybioinformatics．Results：Expressionofifngl-1orifngl-2WasinducedbymedicalbathwithconA．Wesuccessfullyclonedifngl·1andifngl-2andconfirmedthembysequencing．Recombinantexpression