TGFβ1基因转染对软骨细胞生长代谢及其体内成软骨的影响

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1、上海第二医科大学博士学位论文TGF-β1基因转染对软骨细胞生长代谢及其体内成软骨的影响姓名：刘方军申请学位级别：博士专业：外科学，整复外科学指导教师：曹谊林2002.4.1上海第二医科大学博士学位论文⑧hTGF．6lBMPbFGFIGFX-galcDNAPDGFRrr-PCRDEPCPBSBMSCECGFTNFc【CAT】PTGNBTECMdNTPDABBCIPELISAFACSLBDMS0TEMMTTGAGPGSPItRNASSCTEMEDPMSFHEPESEDllARACNEMPKCRbproteinAbbrevi

2、ationHumantransforminggrowthfactor—betalBonemorphogeneticproteinBasicflbroblastgrowthfactorInsuline-likegrowthfactor5-bromo-4一chloro·3一indolyl-6一D—galgcthylenecompletedeoxyribonucleicacidPlateletderivedgrowthfaetorReversetranscriptionalPCRDiethy[pyrocarbonatePho

3、sphatebufferedsalineBoneMarrowDerivedStromalCellsEndothelialeellgrowthfactorTumornecrosisfactoralphaChloramphenicolacetvltransferaselsopropylthio一8一D-galactosideNitrobluetetrazoliumsaltExtracellularmatrixDeoxyribonucleosidetirphosphateDiaminobenzidine5-bromo一4-c

4、hloro··3·indolyl··phosphateEnzyme-linkedimmunosorbentassayFluorescent-activatedeelIsorterLuria-BertanimediumDimethylsulfoxideTransmissionelectronmicroscopeThiazolylblueGlycosaminoglycanProteoglycansProliferationIndexTranSferRNAStandardsalinecitrateN，N，N，’N、-tetr

5、a-mathylethylenediaminePhenylmethylsulfonylfluorideN-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethanesulfonicacidEthyleneDiamine-TetraacidicAcidRabbitAflicularCartilageCellsN．ethylmaleimideProteinkinaseCRetinoblastomaprotein第1页上海第二医科大学博士学位论文⑧TG卜pt基因转染对竣骨细胞生长代谢及其俸肉，成软骨的影响中文

6、摘要目前限制软骨组织工程进展的关键问题是体外培养软骨细胞的功能老化问题．这无疑限制了组织工程技术构建软骨需体外大量扩增种子细胞的要求及其未来的临床应用；同时软骨细胞合成特异细胞外基质功能的逐渐丧失亦不利于体内构建组织]：程化软骨的质量。因，此，体外培养软骨细胞的功能老化问题己成为软骨组织工程发展亟待解决的问题柳究表明：、TGF．B等生长冈子能增加软骨细胞DNA合成，促进软骨细胞增殖，而且体外培养软骨细胞受到TGF—B的刺激作用后，软骨细胞基质n型胶原和蛋白聚糖的合成表达亦增加。可见TGF．8对软骨细胞的生长、增殖及其细

7、胞外基质合成起着重要的调节作用。然而，应用外源性重组生长因子TGF—D时存在半衰期短、局部使用易被稀释或丢失等缺陷和不足，从而限制了其在组织J：程中的应_Ef=

8、。而基因治疗则提供了蛋白的“缓释库”，治疗蛋白作用浓度高，并持续一定的时间，囚此利用分子生物学技术对软骨细胞进行基因修饰＼’己逐渐成y,j软骨组织工程学研究的热点。I本研究探讨脂质体Fugene6载体介导的方法局部应／用TGF—Bl基因对体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质代谢规律等生物学行为的影响，并，初步评价了转染生长网子TGF—Bl对软骨细胞功能老化及体内

9、成软骨能力的影响。仿法：利{用基因重组技术构建pcDNA3，1一TGF—B1真核表达载体，并经限制性内切酶酶切及PCR技术鉴定重组载体是否含有目的基因hTGF—BtcDNA。从转染pcDNA3．卜TGF一口1表达载体的3T3细胞及软骨细胞中抽提细胞总RNA，应用RT—PCR、RNA斑点印迹杂交鉴定目的基因能否在mRNA水平表达，并