重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响

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1、·1806·南方医科大学学报(JSouthMedUniv)2011；31(11)·基础研究·重组腺病毒Ad5F35．SD—EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响史静，胡晶，肖青，彭智，曹唯希，罗秋平，王方，冯文莉重庆医科大学附属第一医院检验科，临床血液学教研室，临床检验诊断学教育部重点实验室，血液科，重庆400016摘要：目的构建表达SH2一DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35．SD．EGFP，观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2一DED融合基因并克隆至腺病毒穿

2、梭载体pAdTrack．CMV中，构建成穿梭质粒pAdT-SD—EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经PmeI酶切后转化pAd5F35．GFP的BJ5183感受态，通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35．sD—EGFP及其突变体，PacI酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35．sD—EGFP经PCR和westernblot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞，通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35．SDEGFP对K562细胞增殖的影响。结果PC

3、R、酶切和测序结果均表明pAdT-SD．EGFP和pAd5F35-SD—EGFP构建成功；PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35一SD．EGFP包装扩增成功，滴度可达1．4x10pfu／ml。转染K562细胞后，Westernblot可检测到目的蛋白的表达，MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2．DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35．SD-EGFP，其对BCR—ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。关键词：Bc

4、r-Abl；SH2；DED；重组腺病毒；AD293细胞中图分类号：Q78文献标志码：A文章编号：1673—4254(2011)11-1806-06ConstructionofarecombinantadenovirusAd5F35．．SD—-EGFPanditseffectonK562cellproliferationSHIling1，HUJinf，XIAOQing3,PENGZhi2,CAOWei—xi2,LUOQiu—pinf，WANGFang~，FENGWen—li2Departmento

5、fClinicalLaboratory,FirstAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversifzDepartmentofClinicalHematology,KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalofEducationMinistryofChina,。DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,ChongqingMedic

6、alUniversity,Chongqing400016，ChinaAbstract：ObiectiveToconstructarecombinantadenovirusvectorforSH2一DEDfusiongeneandassessitsinhibitoryeffectontheproliferationofK562cells．MethodsSH2一DEDfusiongeneanditsmutantSH2mt—DEDwereamplifiedbysplicingPCRandclonedi

7、ntopAdTrack—CMVplasmidseparatelytoconstructtheshuttleplasmidspAdT—SD—EGFPandpAdT—SmD—EGFPrespectively．AfterPmeIdigestion,theshuttleplasmidsweretransformedintoultra—competentpAd5F35BJ5183cellstogeneratedefectiveadenovirusvectorspAd5F35一SD—EGFPandpAd5F

8、35一SmD—EGFPbyhomologousrecombination．Thevectors，linearizedbyPacIdigestion,werefurthertransfectedintoAD293cellsforpackagingandamplifiedbyinfectingAD293cellsrepeatedly．K562cellsweretheninfectedbytherecombinantadenovirusesandtheexpressionofSDwasdetected