haif-1重组腺病毒对a549细胞增殖和迁移的影响

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1、—．古一斯：‘．、，＇＇ｈ．一：０２６／８索取号．２１１：公开．密级遍乐巧絶乂聲硕±学位论文．．画■—．＇■■■．．、＇、．－＇＇’：－Ｖ‘成．ｈＡ－ＩＦ１重组朦房毒对Ａ５４９细舶槽殖和巧移的影晌研堯生：．萝丽尝户—＇－子－：－．．产．－－？－？：指导教师？：曹样荣教授／；．；，；，，培＃单位：生命科学学院ｔ；’＇Ｖ—：好；绞学科：生物学忘二级学科：细胞生物学＇完成巧简＇：２０１５年４月１５日＇—－ｒ答辩肿间

2、２０１５年５，序１８旧．＂，－：．／与■■Ｖ．ｒ／；：．‘■－．■：、Ｖ－．学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的，不包含其他人。本论文中除引文和致谢的内容外或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名；１而曰期；Ｗ坤５於公《学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单

3、位属南京师范大学，可借阅或上网。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档レ、、公布本学位论文的部分或全部内容，可ッ采用影印复印等手段保存汇编本学位论文。学校可Ｗ向国家有关机关或机构送交论文的电子和。（纸质文档，允许论文被查阅和借阅保密论文在解密后遵守此规定）保密论文注释，密级：保：本学位论文属于保密论文密期限为。年：学位论文作者签名：《祕指导教师签名考《禾！；日期：幸手Ｑ巧妇日期ｗｊ年長轉少台Ｍ摘要一Ａ－－ＩＦ１是个大小为１７ｋＤａ，位于细胞质中的巧离子结合蛋白，包含２个ＥＦ－手形结构域，

4、１，能够结合并聚合肌动蛋白在自然界中ＡＩＦ的丰度不高，所Ｗ想－要分离得到大量天然的表达产物困难较大。已有研究证实ＡＩＦ１能够促进血管平滑肌细胞，进而、内皮细胞、巨隨细胞Ｗ及乳腺癌细胞等多种细胞的增殖和迁移－影响相关疾病的发生和发展，Ａ。ＩＦ１与细胞分化之间关系的研究较少发现本实－ｃ－验将人ＡＩＦ，，１ｌＤＮＡ克隆到原核表达载体并用ＩＰＴＧ进行诱导表达纯化ＡＩＦ原核表达蛋白－Ａ５４，初步研究Ａ圧１对人肺细胞株９增殖和迁移的影响，并首次－探讨了ＡＩＦ１与小鼠成肌细胞Ｃ２Ｃ１２分化的相关性。－Ａ－－ＡＩＦ１基因序列ＩＦｌｃＤ

5、ＮＡ克隆２８ａ＋载依据人，设计引物，将人到ｐＥＴ（）’－－体ＥＴ２８ａ＋－，构建ｐｈＡＩＦｌ原核表达载体，转化加ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细（）－菌诱导表达，收集菌体ＳＤＳＰＡＧＥｅｓｔｅｍＢｌｏｔ，电泳及Ｗ分析蛋白表达。超声破－－－－碎菌体，分析蛋白的可溶性并纯化收集ＡＩＦｌ蛋白。结果显示，ｐＥＴ２８ａ〇ｈＡＩＦｌ）一质粒经ＩｍＭＩＰＴＧ诱导化后，ＰＡＧＥ电泳检测在约２０ｋＤａ处有条明显条带，ＩＦ－说明重组蛋白主要Ｗ可溶性形式存在１，镇柱纯化后得到纯度较高的Ａ蛋白。ＤＣ３－－－构建穿梭质粒ｐ１５ＥＧＦＰｈＡＩＦｌ，将穿梭

6、质粒与腺病毒骨架质粒Ｈ创ｏｘｄｅｌｔａＥｌＳＣｒｅ共２９３细胞包装腺病毒ＡＩＦ－１ｐＢ转染，获得表达人基因的重组，ＴＣＩＤ５０法测定病毒滴度，腺病毒，用所制备的重组腺病毒感染Ａ５４９细胞－ＲＴＰＣ民和ＷｅｓｔｅｒｎＢｏｔ鉴定Ａ５４９细胞中ＡＩＦ－，ＭＴＴ法检测细胞增ｌ１表达状态－殖，细胞划痕和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移。结果表明，成功构建了表达ＡＩＦ１８ｘ－基因的重组腺病毒，所得病毒滴度为２．５ｌ〇ｆｕ／ｍｌｐ；用ＡＩＦ１重组腺病毒感染人－ＡＷｅＡＩＦ－５４９细胞，ＲＴＰＣ民和ｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定显示细胞能够过

7、表法１ＭＴＴ显示；过表达Ａ－１可显著增强Ａ５４９ｒａｎｗｅｌｌＩＦ细胞增殖能力；细胞划痕和Ｔ实验证明过表达Ａ－Ａ５４９细ＩＦ１能够促进胞迁移。用２％的马血清培养基诱导Ｃ２Ｃ１２细胞分化，Ｗ肌球蛋白重链（ＭＨＣ）的表达作为细胞分化指标ＷｅｓｔｅｒｎＢｌ－ＩＦ－１ｏｔＰＣ民检测细胞分化过程中Ａ的表，和Ｑ达情况。结果发现，在诱导第３天ＭＨＣ开始表达，Ｃ２Ｃ１２细胞融合形成肌管，之后肌管不断増加变粗ＡＩＦ－，ＭＨＣ表达也逐渐增加，在整个诱导分化过程中１，的表达在蛋白水平上呈上升趋势，但在ｍＲＮＡ水平上呈下降趋势，说明Ｃ２Ｃ１

8、２细胞的分化会影响Ａ－ＩＦ１的表达。－关键词：ＡＩＦ１，，，，原核表达腺病毒増殖迁移，分化ＩＡｂｓｔｒａｃ