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1、·1806·南方医科大学学报(JSouthMedUniv)2011;31(11)·基础研究·重组腺病毒Ad5F35.SD—EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响史静,胡晶,肖青,彭智,曹唯希,罗秋平,王方,冯文莉重庆医科大学附属第一医院检验科,临床血液学教研室,临床检验诊断学教育部重点实验室,血液科,重庆400016摘要:目的构建表达SH2一DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35.SD.EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2一DED融合基因并克隆至腺病毒穿
2、梭载体pAdTrack.CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD—EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经PmeI酶切后转化pAd5F35.GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35.sD—EGFP及其突变体,PacI酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35.sD—EGFP经PCR和westernblot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35.SDEGFP对K562细胞增殖的影响。结果PC
3、R、酶切和测序结果均表明pAdT-SD.EGFP和pAd5F35-SD—EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35一SD.EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4x10pfu/ml。转染K562细胞后,Westernblot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2.DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35.SD-EGFP,其对BCR—ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。关键词:Bc
4、r-Abl;SH2;DED;重组腺病毒;AD293细胞中图分类号:Q78文献标志码:A文章编号:1673—4254(2011)11-1806-06ConstructionofarecombinantadenovirusAd5F35..SD—-EGFPanditseffectonK562cellproliferationSHIling1,HUJinf,XIAOQing3,PENGZhi2,CAOWei—xi2,LUOQiu—pinf,WANGFang~,FENGWen—li2Departmento
5、fClinicalLaboratory,FirstAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversifzDepartmentofClinicalHematology,KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalofEducationMinistryofChina,。DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,ChongqingMedic
6、alUniversity,Chongqing400016,ChinaAbstract:ObiectiveToconstructarecombinantadenovirusvectorforSH2一DEDfusiongeneandassessitsinhibitoryeffectontheproliferationofK562cells.MethodsSH2一DEDfusiongeneanditsmutantSH2mt—DEDwereamplifiedbysplicingPCRandclonedi
7、ntopAdTrack—CMVplasmidseparatelytoconstructtheshuttleplasmidspAdT—SD—EGFPandpAdT—SmD—EGFPrespectively.AfterPmeIdigestion,theshuttleplasmidsweretransformedintoultra—competentpAd5F35BJ5183cellstogeneratedefectiveadenovirusvectorspAd5F35一SD—EGFPandpAd5F
8、35一SmD—EGFPbyhomologousrecombination.Thevectors,linearizedbyPacIdigestion,werefurthertransfectedintoAD293cellsforpackagingandamplifiedbyinfectingAD293cellsrepeatedly.K562cellsweretheninfectedbytherecombinantadenovirusesandtheexpressionofSDwasdetected
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