FEN1功能以及作为抗肿瘤靶点的可行性研究

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1、…索取号：Ｑ２７９／６．５３１：１４１２０１０２１密级：公开南京砰范式＃博士学位论文ＮＮＵｊｆｌｖ＾Ｓ．及ＦＥＮ１功能以及作为抗肿瘤靶点的可行性研究ｆ研宄生：孙洪芳．＇指导教师：郭志刚教授＃＿臂培养单位：牛命科学学院一级学科冷：牛物学；：细朐牛物学：！：！雜暴揉隹＿讓冬：完成时间：２０１８年０３月２０日答辩时间２０１８年０５月１８日＇：Ｉ、審讀編左学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下２。、宂工作和取得的研究成果本论文中除引文外，所

2、有实验數关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含或其它机构己经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研宄所贡献均己在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：來琴丨学位论文使用授权声明研宄生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范。大学学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。（保密论文在解密后遵守此规定）保密

3、论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：么：迁保密期限为年。学位论文作者签名：指导教师签名：、曰期：糾２乂３日期：恥役孓＜３歷摘要一ＦＥＮ１是种多功能、结构特异性的核酸酶，它在维持基因组稳定性上起着重要的作用。体内ＦＥＮ１的合理调控对维持细胞正常生长是至关重要的。我们通ＦＥＮ一过寻找与１相互作用的蛋白而进步深入探宄ＦＥＮ１未知的功能。我们尝试串联亲和纯化等方法获得了与ＦＥＮ１相互作用的蛋白混合物并通过质谱进行鉴定。我们发现ＨＳＰ７０与ＦＥＮ１相互作用并促进ＦＥＮ１的活性和ＢＥＲ的效率。近来，我们

4、在人类癌症样本中发现了ＦＥＮ１的突变，这暗示着突变可能会影响基因组的不稳定性并导致癌症的发生，ＦＥＮ１。然而功能缺失和癌症易感性之间的确切关系仍然不清楚。我们利用与结直肠癌相关的突变体，并分别从分子生化水平、细胞水平和动物模型三个层面对癌症发生的相关机制进行了阐述。首先我们构建ＦＥＮ１点突变，并表达纯化重组蛋白。我们在体外分析了重组ＤＮＡ一蛋白对底物的酶切活性以及结合力，发现这突变失去ＦＥＮ１的ＦＥＮ、ＥＸＯ和ＧＥＮ活性但仍然保留与ＤＮＡ的结合亲和力。接下来我们分析了Ｌ２０９Ｐ突变与野生型ＦＥＮ一１共存对其酶活性的影响

5、，结果发现该突变以种ｄｏｍ－ｉｎａｎｔｎｅｇａｔｉｖｅ的方式影响野生型ＦＥＮ１的功能。最后我们在体外比较了ＳＷ４８０细胞的ＢＥＲ修复能力并同时用重组蛋白进行了ＬＰ－ＢＥＲ的重建。结果发现该突变影响体外以及细胞内的ＢＥＲ效率。我们还研究了Ｌ２０９Ｐ突变在细胞水平的变化。过表达Ｌ２０９Ｐ突变使得ＳＷ４８０细胞对５－ＦＵ和Ｈ０的敏感性更高并且其细胞凋亡比例增加９Ｐ２２。过表达Ｌ２０突Ｓ８０Ａ双变的Ｗ４细胞的内源性损伤增加，表现为ＤＮ链断裂增加。并且该突变导致细胞内出现更多的染色体畸变，包括细胞内异倍体和染色体断裂的频率增

6、加。此外，我们发现含Ｌ２０９Ｐ突变的细胞具有更高的克隆形成能力，并且突变细胞在小鼠异源生长模型上肿瘤形成能力更强。综上所述，与癌症相关的ＦＥＮ１基因的变异会影响机体的ＢＥＲ修复效率，并诱导细胞发生转化。对该突变体的研究揭示了癌症发生的分子机制。基于以上的研宄发现，ＦＥＮ１ＦＥＮ１功能对于正常细胞来讲是必要的，功能缺失将导致肿瘤发生。然而，与此同时，在己经转化成肿瘤的细胞中，其ＦＥＮ１的表达水平远远高于正常细胞。我们发现在乳腺癌细胞中ＦＥＮ１是高表达的，并且ＦＥＮ１对于快速生长的癌细胞是必须的。我们发现改变ＦＥＮ１在细胞

7、中的表达水平会改变癌细胞对于化疗药物的反应。并且，对临床肿瘤样本的分析发现，肿瘤中ＦＥＮ１表达水平越高，肿瘤恶性程度就越高，病人的预后就越差。在细胞中Ｉｍｍ抑制ＦＥＮｌ活性会引起ＤＮＡ复制停滞和未修复的ＤＮＡ中间体的积累，进而导致ＤＮＡ双链断裂和细胞凋亡。因此，ＦＥＮ１我们认为，抑制活性将会抑制肿瘤细胞生长。一ＦＥＮ一基于这设想，我们提出了以１为靶点的抗肿瘤的策略。我们设计了种全新的ＦＥＮ１抑制剂（ＳＣ１３），它可以特定的抑制ＦＥＮ１的活性，并且影响冈－崎片段的成熟和ＬＰＢＥＲ，影响体内和体外的ＤＮＡ复制和

8、修复。ＳＣ１３抑制癌细胞增殖，并导致细胞内ＤＳＢｓ和染色体断裂的产生，癌细胞中染色体的不稳定性进一步