Notch信号通路介导小胶质细胞激活在米诺环素对糖尿病神经病理性痛的保护作用机制研究

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1、分类号：R614学校代码：10062密级：学号：2013701009学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：Notch信号通路介导小胶质细胞激活在米诺环素对糖尿病神经病理性痛的保护作用机制研究TITLENotchsignalingpathwaymediatesmicroglialactivationinthemechanismofprotectiveeffectsofminocyclineondiabeticneuropathicpain一级学科：临床医学二级

2、学科：麻醉学论文作者：杨程指导教师：于泳浩教授天津医科大学研究生院天津医科大学博士学位论文中文摘要背景：糖尿病神经病理性痛（DNP）是糖尿病患者最常见的一种并发症，通常表现为麻木、烧灼感、刺痛、触痛、自发痛、痛觉过敏等，多发生于肢体远端尤其呈对称性。据统计，大约有50%以上的糖尿病患者最终发展为DNP，在各种神经性痛占10%左右。由于疼痛和感觉异常常导致患者感到不适、痛苦和焦虑，部分患者伴有抑郁和自杀倾向，同时糖尿病足截肢也成为非创伤性截肢的主要原因，因此DNP严重影响患者生活质量，加重家庭和社会负担，成为最亟待解决的并发症

3、。目前DNP发病机制尚不清楚，临床通常行对症支持治疗但对疼痛缓解有限且不能阻止病情进展。近年来对DNP的研究主要涉及高血糖应激、物质代谢紊乱、氧化应激、炎症反应等机制，尚未取得突破性研究成果。本课题组前期研究发现小胶质细胞活化、细胞凋亡等因素可能参与了DNP的发生和发展，同时对广谱抗菌药物米诺环素研究发现其除抗菌作用以外还具有神经保护作用，可能成为治疗DNP潜在新型药物。第一部分：观察米诺环素对糖尿病大鼠神经病理性痛的影响。方法：通过腹腔注射STZ65mg•kg-1建立糖尿病模型，在STZ诱导后腹腔注射米诺环素40mg•kg

4、-1和80mg•kg-1，观察STZ诱导前（T1）、诱导后2w（T2）、4w（T3）、8w（T4）各组大鼠一般情况和血糖变化并测定行为学指标热痛阈（TFL、TWL）和机械痛阈（MWT）、神经功能指标（NCV），第8周后处死大鼠行脊髓组织病理切片采用免疫荧光染色观察小胶质细胞标记物Iba-1的阳性细胞分布。结果：通过单次腹腔注射STZ成功建立糖尿病大鼠模型，且糖尿病组在诱导2w后TFL、TWL、MWT、NCV明显较正常组低（P<0.01），痛敏症状明显并持续至第8w；小胶质细胞标记物Iba-1呈高表达，经米诺环素治疗后（Con

5、+Mino40组和Con+Mino80组）可明显增高TFL、TWL、MWT、NCV和降低脊髓背角小胶质细胞Iba-1表达水平（P<0.05）。结论：米诺环素可减轻DNP大鼠疼痛行为学变化、改善周围神经传导速度和抑制小胶质细胞活化，且米诺环素治疗DNP的剂量40mg-1-1·kg优于80mg·kg。第二部分：米诺环素通过抗炎、抗氧化、抗凋亡机制减轻糖尿病神经痛。方法：将Con组、DM组、Con+Mino组、DM+Mino组大鼠饲养8周后处死取脊髓腰膨大采用比色法测定氧化应激和脂质过氧化反应指标SOD、MDA和亚硝I天津医科大学

6、博士学位论文酸盐浓度，ELISA法测定炎症因子TNFα、IL-1水平，免疫组化法观察脊髓背角神经元凋亡水平。结果：与正常对照组相比DNP大鼠脊髓组织SOD表达明显减低，MDA、亚硝酸盐、TNF-α和IL-1明显增高且脊髓背角神经元出现大量凋亡阳性细胞（P<0.01）；经米诺环素治疗的DM+Mino组大鼠较DM组出现SOD表达增加，MDA、亚硝酸盐、TNF-α和IL-1减低，并且脊髓背角神经元凋亡减少。结论：氧化应激、炎症反应和细胞凋亡参与了DNP发生和发展，米诺环素可在抑制小胶质细胞活化的基础上抑制氧化应激反应、减轻炎症反应

7、、减低细胞凋亡，对DNP有神经保护作用。第三部分：Notch信号通路在米诺环素改善糖尿病神经痛中的作用。方法：给予DNP模型大鼠小胶质细胞抑制剂米诺环素和（或）Notch信号通路抑制剂DAPT后观察各组大鼠行为学变化（TFL、TWL、MWT）；采用westernblot法和免疫荧光法测定各组大鼠Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1表达量。结果：DAPT组和Mino组大鼠TFL、TWL、MWT均较DM组大鼠好转（P<0.05），而且DAPT+Mino组行为学改善最为明显（P<0.01），westernblot结果进

8、一步证实给予小胶质细胞抑制剂米诺环素和Notch信号通路抑制剂DAPT后蛋白表达明显减少（P<0.01）。结论：米诺环素可在抑制Notch信号通路活化基础上对糖尿病神经病理性痛发挥治疗作用。综上所述，米诺环素可针对糖尿病神经病理性痛的氧化应激、脂质过氧化反应、炎症反应以及神经元凋亡等损害机