小胶质细胞α7-nachr激活在aβ介导神经干细胞失能中的作用及分子机制研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文小胶质细胞Q7-nAChR激活在A13介导神经干细胞失能中的作用及分子机制研究Aroleandthemechanismofactivatedmicroglia’SQ7-nAChRagainstA13一inducedneurotoxicityonneuralstemcells课题来源：国家自然科学基金(30973162)广东省自然科学基金(07005203)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员药理学韦美丹王勇教授刘中秋教授葛发欢教授张军教授陈吉生教授杨威教授论文评阅人黄河清教授王文雅

2、教授2012年5月20日广州硕士学位论文小胶质细胞Q7-nAOhR激活在AB介导神经干细胞失能中的作用及分子机制研究硕士研究生：韦美丹指导教师：王勇教授摘要阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是老年人中常见的一种中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)退行性疾病。目前传统治疗药物包括抗p．淀粉样蛋白药物、胆碱酯酶抑制剂(CHEI)、抗炎药物、自由基清除剂和抗氧剂、钾通道阻滞剂及脑代谢改善药等。这些药物能相对减轻AD的症状，但都不能阻止病情的进展，因而疗效有限。所以，寻找治疗与预防AD的方

3、法已成为世界所关注的问题。近年来高新技术的发展和应用，尤其是神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)移植技术的不断完善，给治疗AD提供了新的策略和契机。NSCs可以作为细胞供体，对于治疗一些中枢神经系统退行性疾病具有重要的临床意义。不过，至今为止无论是促进AD患者内源性神经细胞生成还是外源性干细胞移植，均未获得成功。其原因可能与AD患者颅内p．淀粉样蛋白(beta．amlyoidprotein，Ap)沉积引起的微环境改变有关。现有研究显示外周迷走神经受刺激后释放的胆碱能神经递质与巨噬细胞烟碱型乙酰胆碱受体(nicoti

4、ncacetylcholinereceptor,a7．nAChR)受体作用，可以抑制巨噬细胞炎性介质的合成与分泌，削弱外周炎性反应。我们前期研究已证明体外培养的小胶质细胞可表达a7．nAChR，A13在体外可诱导该细胞分泌炎性介质增加，而激活a7．nAChR可使A13介导的这些炎性介质生成和分泌降低。因此，明确A13介导的炎症反应能否造成NSCs失能摘要以及激活a7．nAChR削弱炎症反应能否改善NSCs生存环境，促进其增殖、分化能力，减少其凋亡的研究具有非常重要的意义。基于上述研究，本课题将建立离体培养的NSCs体系及小胶质细胞与

5、NSCs共培养体系，明确A131．42作用的小胶质细胞对体外培养的NSCs生存的影响，进一步探讨预激活小胶质细胞a7．nAChR对Apl．42介导的NSCs失能的保护作用；同时从分子水平上观察NSCs增殖分化过程中两类关键的Wnt信号途径调控分子13-Catenin和GSK．3p的动态变化，阐明Wnt／p．catenin信号途径对共培养体系中的NSCs增殖、分化过程中的具体调控作用。这给研究调控神经细胞生成的分子机制提供理论基础，为进一步揭示AD发病机制提供了技术支持，也为临床治疗AD提供新的理论基础。方法1．海马NSCs培养及鉴定

6、新生SD大鼠海马组织中分离出细胞用含20ng／mlbFGF(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、20ng／mlEGF(epidermalgrowthfactor,EGF)、2％B27、2％L．glutamine、1％青链双霉素的DMEM／F12培养液重悬后以1x106／ml接种于25cm2透气培养瓶内。置37。C、5％C02细胞培养箱中培养，每34d半量换液第7d结束原代培养并进行传代培养，每6．7d传代一次。取第3代NSCs进行nestin鉴定；第3代神经细胞球制备单细胞悬液，用109mol／L5．

7、溴．2脱氧尿嘧啶核核苷(5．bromo2．deoxyuridine，BrdU)标记检测细胞的增殖能力；第3代NSCs用含10％胎牛血清(fetalbovineserun_l，FBS)的DMEM／F12培养液进行正常分化处理，分化10d后分别行胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和微管相关蛋白．2(microtubule．associateprotein，MAP．2)免疫细胞荧光染色鉴定细胞多向分化潜能。2．小胶质细胞培养新生SD大鼠海马组织中分离出细胞重悬于含10％FBS的DMEM／

8、F12培养基中，单细胞悬液以5×105／ml细胞密度接种于预经多聚赖氨酸包被处理的H硕士学位论文75cm2透气培养瓶中，37℃、5％C02孵育箱中培养2d后全量换液，待培养至9．10d，手摇法分离纯化小胶质细胞，并通过小胶质细胞特异性