佛波酯诱导小胶质细胞老化介导多巴胺能神经元损伤机制及药物干预研究

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1、中国医科大学博士学位论文佛波酯诱导小胶质细胞老化介导多巴胺能神经元损伤机制及药物干预研究姓名：曹丹申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：任艳201204·中文论著摘要·佛波酯诱导小胶质细胞老化介导多巴胺能神经元损伤机制及药物干预研究目的小胶质细胞(Microglia,MI)是中枢神经系统中最有代表性的免疫细胞，发挥监测脑内异常变化的功能。小胶质细胞对外界环境刺激非常敏感，既可以通过吞噬组织中的病原体及有害颗粒对神经元起到保护作用，也可以通过分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用。有研究证实MI老化后其功能由神经保护向神经损伤转变。老化MI不仅释放的

2、炎症介质显著增多，其对损伤的反应也发生显著改变。这些老化MI并不会迅速死亡而是长期存在于脑内，通过释放炎性介质等持续对多巴胺(Dopamine，DA)神经元生存的微环境施加负面影响，最终导致DA神经元的大量死亡。在帕金森氏病、阿尔兹海默病等衰老相关的神经系统变性病的发生、发展中起着重要作用。细胞衰老可以被多种不同的刺激因素(如氧化应激、损伤、放射、肿瘤蛋白激活、化学诱变剂等)诱导发生，表现为细胞分裂停止或分裂能力下降，并表达一些老化相关的蛋白。癌基因诱导老化(Oncogene．inducedSenescence，OIS)是最常见的病理性老化，这是机

3、体对抗癌症的一种内在保护机制，OIS在细胞受到恶变威胁时引导细胞停止异常增殖，发生老化。癌基因诱导的老化可以保护机体免受恶性肿瘤的侵害，但另一方面老化却是PD的高危因素，即老化减少恶变发生的同时增加了PD的危险，然而大量证据显示PD患者的黑质中恶变倾向和OIS同时并存。因此我们推测帕金森病人脑内的MI为避免恶变的发生通过OIS发生老化，老化的MI不断积累，释放炎症介质，导致脑内微环境的改变，在遭遇其他病理刺激时过度激活，导致或加重DA神经元的损伤。本研究从体外实验考察恶变诱导MI发生老化、老化MI对DA神经元损伤机制、及丁苯酞(3-rl-Butyl

4、phthalide，NBP)干预的保护作用，为探讨和干预PD发病的微环境机制及寻求神经保护治疗奠定基础。方法采用原代培养法进行MI的培养；采用细胞株传代法培养PCI2，替代神经元细胞。给予致癌剂佛波酯(Phorbol12-myristate13．acetate，PMA)持续刺激小胶质细胞。进行下列相关检测：1、采用细胞化学染色法进行衰老相关的B．半乳糖苷酶染色。2、采用流式细胞仪法进行细胞周期检测。3、采用免疫荧光染色法以共聚焦显微镜观察P53、P21蛋白表达荧光强度。4、采用Westemblot进行衰老相关蛋白P53、P21检测并半定量分析。5、

5、采用免疫荧光染色法和流式细胞仪进行细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)检测。6、采用ELISA方法对培养上清中细胞因子进行定量检测。不同剂量的丁苯酞预处理PCI2细胞，再加入低剂量鱼藤酮继续培养后，与老化MI建立共育培养系统。分组如下：A、对照组：培养的PCI2细胞，未给予任何处理药物B、PCI2与老化MI共育C、鱼藤酮损伤PCI2后与老化MI共育D、NBP0．01-tM预处理PCI2细胞+鱼藤酮后与老化Ml共育E、NBP0．1p,M预处J里PCI2细胞+鱼藤酮后与老化MI共育F、NBPllaM预处理PCI2细胞+鱼藤

6、酮后与老化MI共育G、NBPl0肛M预处理PCI2细胞+鱼藤酮后与老化MI共育H、NBPl00I．tM预处理PCI2细胞+鱼藤酮后与老化MI共育1、倒置显微镜下观察PCI2细胞形态变化。2、采用JC-l标记法以流式细胞仪对PCI2线粒体膜电位进行定量检测。3、采用AnnexinV-PI双染法以流式细胞仪对PCI2凋亡进行定量检测。4、采用流式细胞仪对PCI2细胞内活性氧检测。所有数据以殛S表示，应用SPSSl3．0软件进行统计分析，多组资料用One．WayANOVA方法进行比较。以P<0．05或P<0．01为标准认为存在显著性差异。结果1、p．半乳

7、糖苷酶染色结果显示，对照组几乎不表达p．半乳糖苷酶蓝染细胞；PMA刺激小胶质细胞组蓝染阳性细胞数明显增加，且随PMA刺激持续时间的延长蓝染阳性细胞数增加越明显。2、流式细胞分析结果可见与对照组比较，PMA组细胞周期多停滞于G0／G1期，S期明显减少，并且随着PMA刺激持续时间的延长G0／G1期细胞比例逐渐增加，S期比例相应减少；实验组与对照组相比均有统计学差异(P

8、呈时间依赖性地上调表达。PMA刺激MI在24h时p21蛋白质表达逐渐增高(P