沉默信息调节因子1在脂多糖激活小胶质细胞介导多巴胺能神经元毒性损伤中的保护作用

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1、硕士学位论文沉默信息调节因子1在脂多糖激活小胶质细胞介导多巴胺能神经元毒性损伤中的保护作用硕士研究生：叶杰明指导教师：刘振华教授摘萼帕金森病(Parkinson’Sdisease，PD)，一种常见的神经系统变性退行性疾病，目前关于其发病机制研究仍不明确，比较复杂，可能跟遗传因素(致病基因Parkin等的发现)、年龄老化、环境因素(如除草剂、杀虫剂的应用、接触锰金属等)，体内线粒体功能紊乱与氧化应激、谷氨酸的兴奋性中毒、免疫与炎症反应异常、细胞凋亡或泛素蛋白酶体系统的功能受损等因素有关。既往炎症／免疫异常与帕金

2、森病关系的相关研究不多，但最近从流行病调查，对PD患者死后的大脑解剖及帕金森病动物模型的研究发现，越来越有力地表明炎症在帕金森病发病机制中的重要地位。中枢神经系统的小胶质细胞如专职的巨噬细胞，保护着中枢神经系统免受外界感染和损伤，它很容易对免疫原刺激或组织损伤产生应激反应，并显著上调许多细胞因子水平，其中一小部分是营养因子，而大部分是许多炎症因子如肿瘤坏死因子一a(TNF-a)，大量的白介素，如白介素一1(IL—1)和大量自由基如～氧化氮、过氧化物及脂肪酸代谢产物等。普遍认为，小胶质细胞在炎症刺激下被激活，释

3、放的损伤性炎症因子和氧化应激毒性产物如氧自由基等介导了颅内神经元的损伤。沉默信息调节因子(Sirtuins)是一组尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I，NAD+)依赖的III类组蛋白去乙酰化酶，最初在酵母中发现、鉴定并命名为沉默信息调节因子2(Sir2)，目前认为其在许多生物进程中起重要的调节作用，如基因修复、摘要寿命延长、代谢以及氧化应激的调节等。迄今为止，在人类已经发现有7个Sir2的同源物蛋白，分别命名为S1RTl～SIRT7，其中，SIRTl与Sir2同源性最高，也是研究最深入的。SIRTl，该蛋白广泛存在

4、于机体成熟组织中，定位于细胞核内，它具有一个由250个氨基酸残基组成的保守的脱乙酰酶结构域，其脱乙酰化酶活性的必需基团位于第363位赖氨酸上。而且，SIRTI脱乙酰酶活性的发挥跟细胞内的氧化还原反应及新陈代谢相关，并依赖于胞质中[NAD+]／[NADH]的比率，当[NAD+]／[NADH]的比率上升时，SIRTI脱乙酰化酶活性也增强，反之则降低。白藜芦醇(resveratrol，Res，红葡萄酒中富含的一种成分)、漆树黄酮等小分子植物化合物，是其活化剂。SIRTI的抑制剂包括尼克酰胺、sirtinol等。在细

5、胞培养研究中，SIRTI的非组蛋白细胞底物有肿瘤抑制基因p53，核转录因子NF一口B、叉头转录蛋白FOXO家族、核受体过氧化酶体增殖体激活受体一r(PPAR—r)和其共激活物过氧化酶体增殖体激活受体一a(PGC-a)、Ku70与肝脏的X受体(LXR)等，以上底物都跟调控细胞寿命相关基因关系密切。SIRTl能去乙酰化NF～KB、FOXO家族、p53等，进而抑制错误蛋白积聚、保护线粒体功能、干预炎症反应、降低细胞凋亡等方式起神经保护作用，在机体自身延缓神经变性退行性疾病进展中扮演着十分重要角色。脂多糖(1ipop

6、01ysaccharide，LPS)，革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，被广泛认为是刺激大脑产生炎症的炎症源。它能通过激活核转录因子NF-KB，激活蛋白一1(AP—1)，和干扰素调节因子-3(IRF3)等一系列细胞信号转导途径，直接刺激脑内小胶质细胞产生一系列免疫炎性和神经毒性因子，继而促进神经变性退行性疾病的发生和进展。BV一2细胞是国外学者培养出的永久分裂型的初生小鼠小胶质细胞，其与原代培养的小胶质细胞的形态及相关功能十分类似，特别是具有分泌炎性物质等功能。它培养较简单，目前被国内外许多学者应用于药理学、

7、细胞吞噬作用、免疫学等研究领域。PCI2细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤细胞，如正常的肾上腺髓质细胞一样，能合成、贮存多巴胺(DA)，又因该细胞含有的膜受体、酶类也类似大脑内的多巴胺能神经元，因此，PCI2细胞¨硕士学位论文成为学者们研究多巴胺能神经元的一种模型。虽然PCI2细胞不能完全替代多巴胺神经元，但可以间接地作为基础研究提供参考的工具。本研究采用LPS激活BV-2细胞作为小胶质细胞体外炎症／免疫模型，损伤PCI2细胞，旨在揭示SIRTl是否参与LPS激活小胶质细胞介导损伤多巴胺能神经元的过程之中及探索其中可能

8、的作用机制。第一部分SIRTl对脂多糖活化Bv一2细胞分泌IL-6和TNF_a的调节作用研究目的：观察LPS对BV一2细胞形状变化及白介素-6(IL-6)和TNF—a分泌情况的影响，探讨沉默信息调节因子1(SIRTl)在LPS诱导BV-2细胞释放前炎症因子过程中的作用。研究方法：1．BV一2细胞分为对照组及处理组，后者分为LPS组，白藜芦醇组及sirtinol组。对照组常规培养，LPS组分别加入不同