ABCG1通过调控内皮祖细胞的功能改善糖尿病血管病变的作用研究

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1、分类号：R541学校代码：10062密级：学号：2014601098博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：ABCG1通过调控内皮祖细胞的功能改善糖尿病血管病变的作用研究TITLEABCG1amelioratesdiabeticvasculardiseasethroughregulatingthefunctionofendothelialprogenitorcell一级学科：基础医学二级学科：医学生理学论文作者：师莹导师：艾玎教授天津医科大学研究生院二〇一七年五月分类号：R541学校代码：10062密级：学号：2014601098学位类别：科学学位专

2、业学位学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：ABCG1通过调控内皮祖细胞的功能改善糖尿病血管病变的作用研究TITLEABCG1amelioratesdiabeticvasculardiseasethroughregulatingthefunctionofendothelialprogenitorcell一级学科：基础医学二级学科：医学生理学论文作者：师莹导师：艾玎教授天津医科大学研究生院二〇一七年五月天津医科大学博士学位论文中文摘要实验目的：糖尿病（diabetesmellitus，DM）是一种复杂的代谢性疾病，心血管并发症是糖尿病患

3、者发病及死亡的主要原因。内皮祖细胞（endothelialprogenitorcell，EPC）参与维持血管内皮的完整性，当血管受到损伤后，通过再内皮化作用修复损伤的血管。而糖尿病患者外周血循环内皮祖细胞的数量降低，导致内皮祖细胞的功能紊乱。因此，通过干预手段增强内皮祖细胞的功能及外周血中的数量为临床上治疗糖尿病提供理论基础。研究发现，细胞内胆固醇稳态与EPC的生物学功能密切相关。ABCG1（ATP-bindingcassettetransporterG1）介导细胞内胆固醇流出至胞外高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL），但是ABCG1是否参与

4、调控内皮祖细胞的功能尚不明确。实验方法：首先，我们构建STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型，然后实施颈总动脉拉伤手术。为了明确内皮祖细胞在血管损伤修复中的作用，我们进行EPC移植实验，通过尾静脉注射预先用Dil-ac-LDL标记的WTEPCs和TgEPCs，观察再内皮化程度。进一步通过流式细胞术的方法检测小鼠外周血中循环内皮祖细胞的数量，同时分离骨髓来源的内皮祖细胞，通过transwell和matrigel成管实验检测细胞的迁移和成管能力的变化。接下来，腺病毒过表达ABCG1和siABCG1敲低ABCG1的表达进行相应的功能学分析。Westernblot方法检测细胞中eNOS及L

5、yn激酶的活性。实验结果：EPC移植能够明显改善血管损伤修复，而且TgEPCs在损伤血管处的募集程度增加，再内皮化程度也显著升高。流式细胞术结果显示，ABCG1转基因小鼠的外周血中circulatingEPC的数量显著升高，遏制糖尿病对EPCs数量的抑制效应。分离相应的骨髓来源内皮祖细胞，功能实验结果证明，TgEPCs的迁移及血管新生能力增加，恢复糖尿病诱导的内皮祖细胞功能紊乱。给予WT-EPCs和Tg-EPCs高糖处理（25mMD-葡萄糖）48小时，结果发现TgEPCs的迁移及成管功能得到恢复，逆转高糖诱导的对内皮祖细胞的损伤作用。在体外，我们以VEGF为阳性对照，观察A

6、BCG1对内皮祖细胞的迁移及血管新生功能的影响。主要通过分别给予腺病毒(Ad-hABCG1)和小干扰RNA（siABCG1）来过表达或敲低ABCG1的表达，检测内皮祖细胞的相关I天津医科大学博士学位论文功能变化。流式细胞术及实时定量PCR结果显示，腺病毒过表达ABCG1增加内皮特异性标志物（CD31和VEGFR2）表达，而干细胞特异性标志物（CD34和c-kit）表达下降，同时内皮祖细胞的迁移和成管能力增加；相反地，siRNA敲低ABCG1能够抑制内皮祖细胞的分化，迁移和成管能力。进一步地，将wt-EPCs和Tg-EPCs与matrigel混合后，分别注射到野生型和转基因小

7、鼠的背部皮肤，免疫荧光染色结果显示Tg-EPCs在matrigel内形成的新生血管高于WT-EPCs；另外，转基因小鼠的成管能力高于野生型小鼠。相反地，ABCG1缺失后EPCs的血管新生功能显著降低。westernblot结果显示，过表达ABCG1后eNOS磷酸化水平升高，敲低ABCG1后则反之。为了明确在内皮祖细胞中ABCG1是否是通过eNOS发挥作用，我们分离来自eNOS-/-基因敲除小鼠的BM-EPCs，加入ad-ABCG1腺病毒也不能逆转eNOS缺失引起的内皮祖细胞迁移及血管新生能力的降低。因此，ABCG1