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1、外周血内皮祖细胞改善肢体缺血的研究 王辉，王岭，李开宗，凌瑞，孙宝华，李晓军，易军【关键词】内皮；干细胞；移植；外周血【Abstract】AIM:Toestimatetheeffectofhumanperipheralbloodderivedendothelialprogenitorcell(EPC)transplantationontherepairmentoflimbischemia.METHODS:Themononuclearcellsfromhumanperipheralbloodediumsupplemented,20ng/mLVEGFand4ng/mLbFGFinv
2、itro.ThespecificmarkersofEPCoralartery,greatsaphenousartery,iliaccircumflexartery,andmuscularbranchof15Balb/cnudemicebischemia.The6dayadherencecellsmarkedbyCMDiIultipointinjectedintotheleftlocalmusclesofischemiclimbs(EPCgroup)andM199ultipointinjectedintotherightlocalmusclesofischemiclimbs(M199
3、group)inordertoevaluatethetherapeuticeffect.Sevendaysafteroperation,60μgFITCUEAicebgastroemiusinedicroscopy.ThenumberofcapillariesofischemiclimbseasuredbyfactorⅧrelatedantigenimmunohistochemicalstaining.RESULTS:Theculturedcellsatday6expressedKDR,CD133,CD34andv199group(P0.05).Redandgreenfluores
4、cenceiclimbsofnudemiceintheEPCgroup.CONCLUSION:199培养液重悬，以2×108/L的密度接种于一次性培养瓶中.每3d换液，用Hanks液洗掉未贴壁的细胞后加入M199培养液继续培养.在培养的第6日和第14日分别对细胞计数，并制作流式细胞仪检测标本，共12份，分别做KDR,CD133,CD34和vDiI浓度为2mg/L，在37℃孵育5min，4℃15min,PBS洗2次后，2.5g/L胰酶/EDTA消化，离心后重悬于M199培养液中.后肢缺血裸鼠共15只，左后肢局部多点注射扩增后的贴壁细胞，共5mL，细胞总量5×105，为EPC治疗组；右
5、后肢局部多点注射M199培养液，共5mL，为M199对照组.移植标记细胞后的第8日,脱臼处死裸鼠.处死前1h，从尾静脉注入20mg/LFITC标记的的荆豆凝集素3mL.取心、肝、肺、脾、肾及双后肢小腿肌肉40g/L甲醛固定后作石蜡切片，脱蜡后荧光显微镜下观察.1.2.4裸鼠后肢情况的检测手术后每日观察裸鼠后肢色泽、温度的变化和活动情况.双后肢小腿肌肉石蜡切片做vWF免疫组化染色，在光学显微镜下,每张切片随机计数5个×200倍视野内的棕黄色染色管状数取其平均数，表示新生的毛细血管数.统计学处理:计量资料以x±s表示，组间统计处理采用配对t检验，计数资料采用Fisher确切概率检验分析
6、(n=30).所有统计分析采用SPSS11.0软件完成.2结果2.1人外周血单个核细胞的体外培养和鉴定人外周血单个核细胞在培养48h后出现贴壁,从第4日开始出现细胞形态的改变，由圆形细胞逐渐向两端伸展呈纺锤形，数量增多(图1)，在培养第5日出现大量的梭形细胞,可见部分梭形细胞以细胞团为中心呈放射状生长.培养第7~10日,细胞继续增多，可见内皮细胞特异性索条状结构.到第14日铺满瓶底的80%，第6日和第14日细胞计数分别为(3.75±0.36)×108/L和(1.52±0.28)×108/L.培养第6日的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vDiI)和黄绿色(代表FITCUEA
7、)双色荧光的细胞掺入(图2)，说明移植的EPC定向整合到了缺血局部.其他脏器以及M199对照组后肢，则未见双色荧光.图2EPC组后肢肌肉中可见红色和黄绿色双色荧光2.3肢体缺血情况的检测EPC组缺血后肢肌肉中的毛细血管密度高于M199组〔（6.8±1.5）vs（3.8±1.6),P0.05〕,说明EPC组的血管重建过程增强，EPC的移植极大地改善了缺血肢体的恢复.M199对照组中仅有2条后肢未出现明显坏死，3条后肢趾端坏死，10只出现小腿的自动脱落；而在EPC组,有1
