鸡传染性支气管炎病毒广西分离株的致病性研究及实时荧光定量RTPCR检测方法的建立

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1、分类号§墨三墨：三!UDC硕士学位论文鸡传染性支气管炎病毒广西分离株的致病性研究及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立．国家自然科学基金项目(30700599)广西自然科学资金项目(桂科青072803)广西科技攻关项目(0993009．2)广西高等学校优秀人才资助项目(桂教人才0802)论文答辩日期陈秋英学科专业亟随盏医堂指导教师麈羞兰虿

2、』熬援2Q!Q二鱼二!Q学位授予日期答辩委员会主席衄蚕苴数援论文评阅人生鲑担教援：塞瑞良数援一▲-，Ht／嬲嬲炒广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和

3、相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人J,j获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮论文作者躲陈列侠学位论文使用授权说明年石月留日本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文：在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择布口解密后发布(保密论文需注明，并在解

4、密后遵守此规定)敝储签名掀新繇落支≥蝴年歹月必日◆～●·么，气-^净鸡传染性支气管炎病毒广西分离株的致病性研究及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立摘要鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病，给养禽业带来了巨大的经济损失。IBV基因组十分容易发生变异，导致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等发生变异，给本病的防控带来很大的困难。近年来对IBV的分型研究很多，但对致病性没有做进一步的研究，更没有研究致病性和基因组变异之间的关系。结合

5、IBV基因变异的情况，研究其在感染组织中的动态分布情况、消长规律和组织亲嗜性变化，揭示IBV分子变异机理，是目前冠状病毒研究的热点。近年来第3群禽冠状病毒的宿主范围有扩大的趋势，除鸡、火鸡外，野鸽和家鸽等均可感染，但目前缺乏鸡源冠状病毒对鸽的致病性研究。目前检沥JJIBV的方法众多，但存在无法定量的缺陷，病毒的定量检测对致病机理、免疫机理、防控效果的研究都具有重要意义。针对这些问题，本研究进行了IBV的致病性试验以及建立IBV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。首先，在本课题组对26个广西IBV分离株进行基因分型将其分为4个基因型的基础上，从中选择代表4个不同基因型的9个广西IBV分离

6、株进行人工感染雏鸡的试验。结果表明，4个基因型的广西流行毒株对非免疫雏I，、争◆0多鸡均具有致病能力，潜伏期为24h至48h，发病率88．8％至100％；基因型I(与H120亲缘关系很远)的GX．YL5、GX—C、GX．YL9、GX．NNl和GX．NN6能引起试验鸡死亡，死亡率可达11．1％．44．4％，并引起呼吸系统和泌尿系统的病变：试验鸡可带毒和通过泄殖腔排毒42天。而与H120亲缘关系很近或与4／91亲缘关系很近的广西分离株未能引起试验鸡死亡。第二，应用本课题组建立的套式RT-PCR对人工感染GX．YL5分离株的雏鸡不同脏器中的病毒进行跟踪监测和组织病理学观察。结果表明肝脏和肺带

7、毒19天，胸腺和腺胃带毒2l天，盲肠扁桃体和气管连续带毒26天，肾脏带毒长达40天，感染鸡带毒和排毒持续时间可达42天；病毒能引起气管分泌粘液、气管和细支气管纤毛脱落、炎症细胞浸润，肺充血、淋巴细胞浸润，导致肾脏发生间质性肾炎以及法氏囊水肿。结果显示该毒株不但致病力强，排毒时间长，而且具有广泛的组织嗜性，能引起多个器官组织细胞结构发生变化。第三，选择对鸡致死率最高的分离株GX．YL5及与鸽源冠状病毒Sl基因高变区同源性很高的分离株GX．YL2对鸽子进行攻毒，结果显示GX．YL2和GX．YL5分别引起50％和25％鸽子出现呼吸道症状，并可以在鸽子体内进行增殖，带毒28天，但通过泄殖腔排毒

8、不明显；鸽子感染IBV的解剖病变包括气管分泌粘液，肺出血，胰脏出现水肿及炎症，组织切片观察见到胰腺中性粒细胞浸润、水肿，气管上皮细胞肿胀，肺出血等。整个实验过程未见到致鸽子死亡。表明了对鸡具有较强致病能力的鸡源IBV可以感染肉鸽，能在肉鸽体内不同组织中增殖，对肉鸽有一定的致病力，但对鸽子致病力不强。II第四，为了更好地研究IBV的病毒载荷量与致病机理、免疫机理、防控效果的关系，本课题建立了灵敏度高、特异性强、可重复性好的SYBRGreenI实时