鸡传染性支气管炎病毒bd株生物学特性鉴定及rtpcr检测方法的建立

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1、摘要鸡传染性支气管炎(Avianinfectiousbronchitis，IB)是由冠状病毒科(Coronaviridae)鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。此病多发于幼年鸡，病鸡的特征性临床症状为咳嗽、喷嚏、气管哕音，蛋鸡产蛋量及蛋品质下降，对鸡的肾脏和生殖系统还可造成一定的损害。IB在世界范围内分布，虽然已广泛应用疫苗，但由于各血清型的分离毒不断出现，其发生仍然十分普遍，给养殖业造成严重的经济损失。目前，我国m的发生己经遍布全国大部分省、市和自治区，给养鸡业造成了巨大的损害。本研究主要是从河北

2、保定地区某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病鸡病料中分离到一株病毒，命名为BD株，并对其生物学特性进行鉴定，进而建立起一套快速准确地临床检测方法。无菌采集疑似鸡传染性支气管炎病料，将病变明显的肾脏、器官、肺脏制成病毒液，按照常规实验方法经9～11日龄SPF鸡胚传代，鸡胚在接种后2～9天内出现卷曲、侏儒胚等IBV致鸡胚特征性病变。在电镜下可以见到典型的冠状病毒粒子，未见到其他病毒粒子。所见病毒粒子呈圆形，有稀疏排列的纤突。未经胰酶处理的尿囊液对SPF鸡红细胞没有凝集作用。攻毒后，BD株接种鸡仅在l~2d出现轻微的临床症状，表现为病鸡呼吸困难、羽毛松乱、精神沉郁。攻毒后第4d，部分接毒鸡开始

3、死亡，死亡时间在5～11天不等。多数病鸡剖检后，肉眼可见到器官出血、水肿、盲肠扁桃体等器官出血。所有死亡鸡均表现肾脏肿大、苍白，肾脏和输尿管内有白色的尿酸盐沉积，呈典型的“花斑肾”。随着病程延长，肾脏肿大更加明显。将病毒液进一步经致鸡胚矮小化试验、新城疫干扰试验，试验结果都符合IBV生物学特性。以分离病毒的eDNA为模板，通过RT-PCR技术扩增出M基因405bp长的片段，从核酸水平证实了所分离的病毒为IBV。以上鉴定结果表明从该鸡场分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。本试验对BD株进行了理化特性的研究，该病毒经氯仿和乙醚作用后EID50发生明显的变化，表明BD株对二者敏感；耐热性试

4、验表明BD株对热敏感，但二价镁离子可提高此病毒对热的耐受性；酸碱敏感试验表明BD株对PH3．0与PHl2．0的酸碱环境均有一定的抵抗力。经双向琼脂扩散试验，兔抗鸡胚毒血清琼扩滴度为1：64；通过半数鸡胚感染量的交叉中和试验鉴定分离株的血清型，结果BD株与M4l标准毒株有一定交叉反应，中和试验R值为67％，表明BD株病毒与M4l标准毒株为同一血清型不同亚型。根据GenBank已发表的30株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M基因序列，设计一对引物，扩增出405bp特异性核酸片段，建立了检测IBV的RT-PCR方法。特异性试验结果表明，IBVM41标准株和BD株均能扩增出405bp的核酸片段

5、，而新城疫病毒(NDv)、鸭肝炎病毒(DHV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、正常鸡胚尿囊液无特异性条带出现。敏感性试验结果表明，该方法的最低检出限量为5x10一EID50的模板。表明本试验所建立的RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强的特点。利用建立的RT-PCR方法对从河北省分离的12份临床上疑似的鸡IBV进行检测，结果阳性检出率为83．3％．该方法的建立为IBV的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。关键词：鸡传染性支气管炎病毒；鉴定；生物学特性；RT-PCR检测方法建立IdentificationofBiologicalCharacteristicsandEstablishme

6、ntofRT—PCRProtocolBDStrainofInfectiousBronchitisVirusAuthor：．JinQinSupervisor：ProfessorYangRundeSpecialty：．PreventiveVeterinaryMedicineAbstractInfectiousbronchitis(IB)ischaracterizedbycoughing,trachealrales，sneezing，andlesionsinkidlleyandreproductivetract．1'llisdiseasecancausemortalityinyoungch

7、ickensandresultineconomiclossesduetopoorweightandreductionineggqualityandquantity．Infectiousbronchitisvirus(IBV)，thecausativeagentofIB，istheprototypeoftheCoronaviridaefamily．Thevirushasaworldwidedistributionandmanydifferentvariant