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《兔出血症病毒分离鉴定VP60基因克隆及RTPCR检测方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、四川农业大学硕士论文屮文摘要兔出血症（Rabbithemorrhagicdisease,RHD）是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的急性高度接触性传染病，给养兔业造成巨大的经济损失，为了在生产中防制该病，有必要对毒株进行分离鉴定及其特性研究，以及建立一种灵敏、准确的检测方法.本研究从兔病料中分离鉴定岀了3株有不同血凝性的兔出血症病毒，分别命名为P3_IDVIhn-1,2,3,毒株经兔体传至3代后，能引起RHDV抗体为阴性的家兔发病及死亡呈现稳定的规律性.其中一hn.2株血凝效价为1：640,曲fr1,3的血凝效价仅分别为1：5,1:1
2、0,但琼扩实验及对流免疫电泳均能看到清晰的沉淀线，电镜负染可见大量球形，核心密度不同、大小约30hm的病毒粒子.根据GenBank中的舶V的全基因序列，设计1对长为29bp的引物，在两引物的5,端加入EcoRI和XbaI酶切位点，对兔出血症病毒vP60基因进行RT—PCR扩增，扩增出约1.7kb的衣壳蛋白VP60基因的完整片段，将其插入克隆载体PMD18—T上，构建重组质粒pMHP60-1,2,3,对重组质粒的测序显示，VP60基因全长1740bp,共编码579个氨基酸，并在GenBank中注册（發录号分别为DQ069280,DQ069
3、2810DQ069282）・将3株跚Dv及卅界上其它RHDV,以及RCV,EBHSV的VP60基因序列进行多序列比对，结果显示一hrr1与whn—2同源性为96.1%,whrr1与whn—3同源性为96.5%,whn-2与whn—3同源性为99.4%,比对序列中所有RHDV与RCV的同源性为84.7%—86.4%，与EBHSV的同源性为69.0%—70.5%,而P31DV各毒株Z间同源性为89.75—39.4%,表明VP60是一个很保守片段.在遗传迓化上，世界各地的RHDV毒株在核昔酸水平上趋向4个支谱系，在氨基酸水平上趋向3个支谱系，
4、谱系问没有明显的地理或时I闻特征，RHDVIhn-1,2,3株分布在2个不同的谱系中，与咖V为同一属的EBHSV和Rc1『分别组成两支不同的谱系，以上结果对认识RHILy的变异趋势具有参考价值。利用软件分析了分离毒株的分子量，疏水性、抗原性、表面可能性、密码子偏爱性和二级结构等分子结构特征，并推测可能与其血凝性最相关的氨基酸位点为P2区的第304、305位，及E区的第432位；其次是F区的第480、508位•该分析结论在国内外未见系统报道，为RHDV的分子生物学增添了新的资料.根据GenBank中的衣壳蛋白VP60基因内的保守序列，用P
5、rimer5.0设计出1对可扩增出VP60基因内部约496bP的部分片段的引物，建立了检测RHDV的RT—PCR方法，并采用该RT-PCR方法对人工致死家兔体内的RHDVi差tYT检测；该方法特异性强，重复性好，灵做度高,检测RHDV的RNA的灵敏度可达2.15us/m1•本研究建立的优于卧的灵敏度高、特异性好的RT-PCR方法及其P,HDV抗原检测结果在国内未见报道・本研究分离鉴定出冇不同血凝性兔出症病毒株，并对英衣壳蛋OVP60基因进行了克隆和相应生物信息学分析，建，OT检测RHDV的RT—PCR方法，为RHDV的地方毒株的分子牛物
6、学及其结构特征增添了新的资料，并为牛产中RIIDV的检测提供了科学依据和一种灵敏、准确的检测方法.关键词：兔出血症病毒；衣壳蛋白；VP60基因；序列分析；RT-PCR检测II四川农业人学硕士论文The1sohfionandIdentificationandtheCloningofCapsidProteinVP60GeneofRHDVstrainsandRT—PCRDetectionforRHDVTianLagCPreventiveVeterinaryMedicine)DirectedbyPro£WangHong—ningAbstract
7、：.Rabbithemorrhagicdisease(IbD),whichiscausedbyRabbithemorrhagicdiseaseVirus(R)田)V).isarat蛔"oome,白taiandcontagiousdiseaseandca11oosa1oHnou¥economylossinrabbit自皿她Tocontro1thedi鬻as岛it，snoo觑略arytoiso1ateandid_a俯匆thevirus虫曲肌andstudytheirmolecular虫
8、H
9、metII地characteristics,越w
10、e11越developasensitiveandaccuratedetec血喀md枷forRHDV.Inthisresearch,threestrainsofRHDVwereisolatedandident
